分散固相萃取-UPLC-MS/MS法测定水蛭中10 种磺胺类药物残留

王小乔，许晓辉*，张虹艳，冯 翀, ，孙玉婧，吴福祥，潘秀丽，李 赟

（1. 兰州市食品药品检验检测研究院/国家市场监管重点实验室（食品中农药兽药残留监控），甘肃 兰州 730050；2. 兰州理工大学 生命科学与工程学院，甘肃 兰州 730050；3. 兰州职业技术学院，甘肃 兰州 730070）

中药材水蛭是由水蛭科动物蚂蟥、水蛭或柳叶蚂蟥经炮制而得的干燥品，具有破血、逐瘀、通经的功效，临床广泛用于治疗徽瘕、痞块、血瘀闭经、跌打损伤等症[1-2]。随着水蛭的需求量增加，传统野生水蛭供应已不能满足市场需求。为了保护野生资源、化解供需矛盾，人工养殖逐渐成为水蛭的主要来源[3-5]。磺胺类药物有抗菌高效、化学性质稳定、使用方便和价格便宜等优点，被广泛应用于水产养殖业。目前，由于在水蛭养殖过程中有不规范或超量使用抗生素类兽药的情况，导致兽药在水蛭体内不能完全代谢；且磺胺类药物在人体内蓄积后会产生细菌耐药性，且有潜在的致癌性，不利于人体健康[6-8]。我国食品安全国家标准《GB 31650-2019 食品安全国家标准 食品中兽药最大残留限量》对动物源性食品中磺胺总量作了明确规定，动物源性食品中磺胺类药物的最高残留限量（MRL） 为 0.1 mg/kg[9]。当前，水蛭中磺胺类药物残留的检测方法未见报道，因此，建立一种高效、便捷、准确检测水蛭中磺胺类药物残留的方法具有重要的研究意义。

目前，关于磺胺类药物残留的检测技术方法主要包括酶联免疫法、高效液相色谱法、超高效液相色谱-串联质谱法（UPLC-MS/MS）等[10-16]。前两种方法检出限高，对复杂样品的检测灵敏度不高，难以适用基质复杂的样品；而UPLC-MS/MS能解决这一短板，适用于复杂组分中痕量药物残留测定。本研究采用分散固相萃取方法进行前处理，以不同配比的3种净化填料（PSA，C18，MgSO4）为组合进行净化效果对比试验，优化提取净化条件，建立了一种UPLC-MS/MS测定水蛭中磺胺类药物残留的方法，能满足水蛭中磺胺类药物残留的快速检测需求。

1 仪器与试药

1.1 仪器

1290超高效液相色谱-6460C三重四极杆串联质谱仪：配有电喷雾离子源（美国安捷伦）；电子天平（梅特勒-托利多）；移液器：20 μl，100 μl，1.0 ml（德国艾本德）；涡旋混匀器（美国Scientific Industries）；5810R离心机（德国艾本德）；SBL-10DT超声波清洗器（宁波新芝）；IQ 7000 超纯水机（美国默克密理博）。

1.2 材料

甲醇、乙腈、乙酸乙酯（色谱纯，德国默克集团）；甲酸、乙酸铵（色谱纯，东京化成工业）；硫酸钠、氯化钠（分析纯，国药集团化学试剂公司）；PSA，C18（月旭科技）；MgSO4（分析纯，天津百世）。

对照品：磺胺二甲嘧啶（批号：100411-200501，纯度：100 %，中国食品药品检定研究院）；磺胺间二甲氧嘧啶（批号：G122608，纯度：99.5 %）、磺胺邻二甲氧嘧啶（批号：G151421，纯度：99.1 %）（Dr. Ehrenstorfer GmbH）；磺胺嘧啶（批号：100026-201404，纯度：99.7 %，中国食品药品检定研究院）；磺胺间甲氧嘧啶（批号：97864，纯度：99.1 %，曼哈格公司）；磺胺喹噁啉（批号：G992252，纯度：96.3 %）、磺胺甲噁唑（批号：G150000，纯度：99.5 %）、磺胺甲基嘧啶（批号：G982705，纯度：99.1 %）、、磺胺二甲异噁唑（批号：W1004574，纯度：99.53 %）、磺胺噻唑（批号：G980077，纯度：99.2 %）（Dr. Ehrenstorfer GmbH）；实际检测样品购于市场。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：ACQUITY BEH C18柱（1.7 μm，2.1 mm×100 mm）；流动相A：含0.1 %甲酸-2 mmol/L乙酸铵-水，流动相B：含0.1 %甲酸-乙腈；梯度洗脱程序：0～2.0 min，15 %～30 %B；2.0～3.0 min，30 %～40 %B；3.0～4.5 min，40 %～90 %B；4.5～6.5 min，90 %B；6.5～7.0 min，90 %～15 %B；7.0～8.0 min，15 %B；流速：0.3 ml/min；柱温：35 ℃；进样体积：2 μl。

2.2 质谱条件

离子源：喷射流电喷雾离子源（AJS ESI）；离子极性：正离子；干燥气流速：6 L/min；雾化器压力：45 psi；离子源温度：325 ℃；毛细管电压：4000 V；鞘气流速：10 L/min；鞘气温度：350 ℃；监测模式：多反应监测模式（MRM）；优化后的质谱参数见表1。

表1 10 种磺胺类药物的质谱参数

2.3 溶液制备

2.3.1 标准溶液制备 分别精密称取各磺胺类药物对照品适量，用乙腈配制成浓度约为 1 mg/ml的单标标准储备液，置 4 ℃冰箱冷藏备用；取各单标标准储备液适量，用乙腈配制成浓度约为 1 μg/ml的混合标准使用液，置 4 ℃冰箱冷藏备用；取混合标准使用液适量，用乙腈配制成浓度分别为0.05，2，5，10，20，30，40，50 ng/ml的标准曲线溶液。

2.3.2 供试品溶液制备 精确称取1 g粉碎水蛭样品置入50 ml离心管，加入3 ml Mcllvaine-Na2EDTA缓冲液，涡旋摇匀，使样品充分润湿复原，加入均质子，涡旋1 min，精密加入10.00 ml乙腈，涡旋1 min，在800 W功率下超声提取5 min ，加入1 g氯化钠和4 g硫酸钠，充分涡旋2 min，于4 ℃以3900 r/min离心10 min，取上清待净化。

取待净化液2 ml置入预先装有100 mgPSA、150 mg C18、900 mg MgSO4的离心管，涡旋1 min，于4 ℃以3900 r/min离心10 min，上清过0.22 μm滤膜，供液相色谱串联质谱仪测定。

2.4 线性关系、检出限及定量限

取混合标准使用液适量，配制成不同质量浓度的系列标准曲线溶液，在优化的仪器条件下测定，以各待测物质谱响应值为纵坐标（y），对应浓度为横坐标（x），绘制标准曲线（见表2）。由表2可见，10 种磺胺类药物在0.05～50 ng/ml范围内线性关系良好，R2均大于0.99。以基质标的3 倍和 10 倍信噪比时的检测浓度为方法的检出限和定量限，检出限为0.19～1.16 μg/kg，定量限为0.56～3.95 μg/kg。

表2 10种磺胺类药物的线性关系、检出限及定量限

2.5 回收率与精密度

选用水蛭空白样品作为基质进行加标回收实验，添加50，100，200 μg/kg 3个浓度水平的混合标准使用液，按照2.3.2项下方法与步骤处理加标样品，上机测定，每个添加水平重复6次实验，结果见表3。由表 3可见，10 种磺胺类药物的平均回收率在65.2 %～98.0 %之间，日内相对标准偏差（RSD）为1.9 %～8.3 %，日间相对标准偏差（RSD）为3.5 %～9.2 %，表明此法的准确度和精密度满足定性定量检测要求。

表3 10 种磺胺类药物的回收率与精密度

2.6 耐用性

在质谱条件不变情况下，分别测定用空白基质溶液与乙腈稀释配制的同浓度混合标准使用液，在流速、柱温、进样量等参数产生微小变动时，考察提取色谱图、总离子流图及质谱响应的变化。结果表明，这些参数发生微小变动对检测结果的影响很小，表明此法有良好的耐用性。

2.7 磺胺类药物残留稳定性

药物在基质残留的稳定性受样品储存条件的影响，磺胺类药物本身化学性质稳定，在畜禽及水产品中的稳定性已被研究证实。如2011年中国合格评定国家认可委员会组织了畜禽肉中磺胺类药物残留的稳定性试验的能力验证工作，结果表明，磺胺类药物在该类基质中化学性质稳定[17]。有文献采用水产品基质加标的方法[18-19]，考察磺胺类药物残留在常温、反复冻融和低温保藏等条件下的稳定性，结果表明，磺胺类药物残留在水产品中的稳定性较强，同理，样品水蛭中磺胺类药物残留也比较稳定。

2.8 样品测定

采用建立的方法对市售10批次水蛭中10种磺胺类药物进行测定，均未检出上述10 种磺胺类药物。

3 讨论与结论

3.1 色谱质谱条件优化

3.1.1 色谱条件优化 因磺胺类药物有一定酸性，易溶于甲醇、乙腈等有机溶剂，因此，选择了常用的反相 C18色谱柱进行分离。进一步考察不同流动相体系的分离效果和响应，在流动相的选择上，为了提高目标化合物的离子化效率，对比了含不同浓度配比的甲酸和乙酸铵的水溶液，及含不同浓度甲酸的乙腈、甲醇对分离效果和质谱响应的影响。结果表明，有机相为0.1 %甲酸-乙腈，水相为0.1 %甲酸-2 mmol/L乙酸铵-水，各个被测药物峰形和分离效果最佳，化合物的质谱响应值增强，因此，最终选择0.1 %甲酸-2 mmol/L乙酸铵-水与含0.1 %甲酸-乙腈作为流动相。

3.1.2 质谱条件优化 通过对各药物对照品溶液单标进样，电喷雾正离子扫描模式下，优化各个药物的母离子、子离子、碎裂电压、碰撞能量等质谱参数，并选择干扰小且响应值高的离子对作为定性离子和定量离子，建立多反应监测方法。

3.2 提取溶剂的选择

比较乙腈、甲醇、乙酸乙酯3种常用提取溶剂的提取效率，结果表明，当甲醇为提取溶剂时，回收率为43 %～76 %，且大多数测定药物的回收率小于70 %；当用乙酸乙酯提取时，回收率为49 %～79 %，且磺胺喹噁啉和磺胺甲噁唑的回收率均小于50 %；当乙腈为提取溶剂时，目标物的提取效果最好，回收率提高至79 %～87 %，原因可能是乙腈能很好地使样品中蛋白质变性，并在萃取盐包及低温高速离心的作用下，促使提取液的水相和有机相分层，进而通过离心去除蛋白脂肪等杂质，降低分析液中基质干扰物的含量。因此最终选择乙腈为提取溶剂（见图1）。

图1 不同提取溶剂的提取效率

3.3 净化方法的确定

设计9组不同配比的净化剂组合（见表4），并考察了不同净化剂组合的净化效果，结果见图2。用PSA 100 mg、C18150 mg、MgSO4900 mg组合净化时，对目标检测物净化效果较好，10 种磺胺类药物的回收率分布在80 %～100 %之间。其中，磺胺嘧啶和磺胺二甲嘧啶回收率接近100 %，最终选择PSA 100 mg、C18150 mg、MgSO4900 mg组合作为净化剂。

图2 不同组合净化剂提取回收率的对比

表4 不同组合的净化剂

3.4 基质效应

水蛭作为基质较复杂的样品，进行质谱分析时基质残留对目标物的离子化会产生影响，因此考察基质对目标物检测的影响。用空白基质溶液与乙腈分别配制同浓度的标准溶液，以两者质谱响应值比值的百分数评价基质效应（ME），若ME大于100 %，则有基质增强效应，相反，则为抑制效应；若ME接近100 %，则不存在基质效应。本实验测试了10 ng/ml和20 ng/ml两个浓度水平，结果表明，20 ng/ml时，除磺胺二甲嘧啶有基质效应增强效应外，其余目标待测物均有不同程度弱的基质抑制效应，其ME大于75 %。10 ng/ml时，磺胺二甲嘧啶和磺胺嘧啶ME接近100 %，无基质效应；磺胺间甲氧嘧啶、磺胺喹噁啉、磺胺甲噁唑、磺胺二甲异噁唑ME在70 %～80 % ，表明有中等基质抑制效应，其余目标待测物ME为80 %～89 %，有弱的基质抑制效应。虽然各待测物有不同程度弱或中等基质效应，但均在可接受的范围内，对检测结果不产生影响（见图3）。

图3 10种磺胺类药物的基质效应

3.5 结论

综上，本研究首次建立了一种基于分散固相萃取净化的超高效液相色谱-串联质谱法测定水蛭中10种磺胺类药物残留的分析方法。该分析方法以缓冲盐溶液复原干燥样品，以乙腈为提取溶剂变性沉淀样品中蛋白质，通过加入盐包，使提取液中的水相和有机相在饱和盐存在下实现分层，通过离心去除蛋白质。以分散固相萃取为净化手段，选择100 mg PSA、150 mg C18、900 mg MgSO4组合为净化剂，对提取液进行进一步净化。对建立的方法进行方法学验证，其各项参数均满足准确定量检测的要求。本研究建立的方法操作简便、准确性良好，可为中药材水蛭中磺胺类药物残留的快速检测提供技术支撑。