壳多糖酶3样蛋白1对人脐带来源间充质干细胞成脂和成骨分化的调控作用

李曼，刘伟江，袁福临，白海涛，李雪，王洋，刘元林，焦宏，张毅

（1.河北北方学院基础医学院，河北张家口 075000；2.军事科学院军事医学研究院辐射医学研究所，北京 100850）

间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSC）是一种起源于中胚层具有良好多向分化潜能的成体干细胞，其来源广泛，可自骨髓、脐带、脐带血、胎盘、牙髓和脂肪等多种组织中分离获得，可分化为骨、软骨、脂肪、成肌细胞和神经细胞等。由于具有自我更新和多向分化潜能，MSC被认为是再生医学领域重要的种子细胞，其临床转化应用也成为研究的热点［1-2］。相对其他来源的MSC，人脐带来源MSC（human umbilical cord-derived MSC，hUCMSC）具有取材方便、免疫原性小、多潜能特性在体外保留时间长等优点，每厘米脐带含约4×105MSC，数量远高于骨髓，因而被认为是再生医学的候选细胞，在组织工程和细胞疗法中受到广泛关注［3］。

MSC 可在特定的组织内环境下分化为成骨细胞、软骨细胞和成脂细胞，其向成脂和成骨分化是一个动态平衡过程，不同的诱导分化条件会改变MSC的微环境，调控其向成脂肪细胞和成骨细胞之间的分化平衡［4-5］。当此平衡被打破，尤其是成脂分化能力占优势时，会引起骨质疏松和年龄相关性骨丢失等骨代谢方面的疾病［6］。因此，近年来关于如何调控MSC 分化能力并维持成脂与成骨细胞的分化平衡成为关注热点，为更好地治疗相关疾病提供依据。

本实验室前期通过MSC 转录组学测序发现，壳多糖酶3 样蛋白1（chitinase-3-like protein 1，CHI3L1）基因在hUC-MSC 中高表达，且生物信息学分析发现其可参与MSC多向分化调控。CHI3L1是哺乳动物几丁质酶基因家族成员，其编码的蛋白是分泌型糖蛋白，与壳质酶同属18 糖基水解酶家族，是Johansen 等［7］于1992 年在人软骨瘤细胞MG63 中发现的一种相对分子质量为40 000 的蛋白质。以往研究表明，在一些诸如支气管哮喘、肺炎和脑膜炎等炎性疾病中，CHI3L1 均发挥一定的生物学作用［8］。CHI3L1 还参与辅助性T 细胞2（helper T cells 2，Th2）和Th17 细胞及白细胞介素18 介导的炎症反应和组织纤维化过程，抑制Ⅰ型免疫反应和细胞毒性［9］。亦有研究表明，CHI3L1对内皮细胞、成纤维细胞和软骨细胞功能均有一定的诱导作用［10］。

CHI3L1 参与Smads 通路形成，激活转化生长因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）下游的信号通路等，且这些通路均与MSC 成脂和成骨分化功能密切相关［11］，但关于CHI3L1 调控MSC 多向分化作用的研究目前尚未见报道。为此，本研究通过构建稳定敲低CHI3L1的慢病毒载体并转染hUC-MSC，观察CHI3L1 对hUC-MSC 成脂和成骨分化能力的影响。

1 材料与方法

1.1 细胞、主要试剂和仪器

hUC-MSC，军事科学院军事医学研究院辐射医学研究所。胎牛血清、α-MEM 培养基、PBS 缓冲溶液、0.25%胰酶、FITC-抗人CD14 或APC-抗人CD14、PE-抗人CD73、FITC-抗人CD34 或APC-抗人CD34、PE-抗人CD90、FITC-抗人CD45或APC-抗人CD45、PE-抗人CD105、RIPA 裂解液、蛋白标准品和ECL 化学发光显色试剂盒，美国Thermo Fisher Scientific 公司；吉姆萨染液，上海碧云天生物技术有限公司；10%中性甲醛和异丙醇，国药集团化学试剂有限公司；慢病毒载体由吉凯基因生物工程有限公司构建；实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR，RT-qPCR）引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，引物序列见表1；吲哚美辛、嘌呤霉素盐酸盐、地塞米松、红油O 粉、胰岛素、维生素C 磷酸盐、β-磷酸甘油、丙酮溶液、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（3-isobuty-1-methylxanthine，IBMX）、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）染液和TRIzol试剂，美国Sigma公司；兔抗人CHI3L1单克隆抗体和小鼠抗人GAPDH 单克隆抗体，美国Cell Signaling 公司；RTase M-MLV、RNA 酶抑制剂、dNTP、5×RTase M-MLV 缓冲液、Oligo dT 和随机引物，日本TaKaRa 公司；DTT、ddH2O 和2×Ultra SYBR 混合物，康为世纪有限公司。梯度PCR 仪、7500 Real time system 和低温高速离心机，美国ThermoFisherScientific公司；倒置显微镜（CKX53SF-R）和荧光显微镜（U-LH100HG），日本Olympus 公司；酶标仪（Bio-Tek）和流式细胞仪（BD FACSCali⁃burTM），美国BD公司；细胞培养箱，新加坡ESCO 科技有限公司。

Tab.1 Primers for real-time quantitative PCR(RT-qPCR)

1.2 hUC-MSC培养和鉴定［12］

复苏的P2 代hUC-MSC 接种于75 cm2细胞培养瓶中，α-MEM 完全培养基（含10%胎牛血清）培养。待细胞融合度达约80%弃培养基，PBS 润洗2 次，0.125%胰蛋白酶消化成单细胞悬液；离心（110×g，10 min），用α-MEM 完全培养基（含10%胎牛血清）重悬细胞进行细胞计数。

取3×105细胞接种于35 mm 平皿中，吉姆萨染色，显微镜下观察细胞形态；流式细胞术检测细胞表型，流式抗体为FITC-抗人CD14、PE-抗人CD73、FITC-抗人CD34、PE-抗人CD90、FITC-抗人CD45和PE-抗人CD105。其他细胞接种于75 cm2细胞培养瓶中，置细胞培养箱内继续传代培养。

取部分hUC-MSC 接种于6 孔板，按文献［13］进行诱导分化。成脂诱导分化体系为：地塞米松1 μmol·L-1，胰岛素10 μg·L-1，IBMX 0.5 mmol·L-1和吲哚美辛0.5 mmol·L-1，诱导分化14 d。成骨诱导分化体系为：地塞米松0.1 μmol·L-1，维生素C磷酸盐50 μmol·L-1和β⁃磷酸甘油10 mmol·L-1，诱导分化12 d。分别采用油红O 染色和ALP 染色检测成脂和成骨分化能力，RT-qPCR 检测成脂和成骨关键转录因子mRNA 表达，即脂肪酶（adipsin，ADI）和过氧化物酶体增殖物激活受体γ（peroxi⁃some proliferator activated receptor-γ，PPAR-γ）mRNA 表达及ALP和骨桥蛋白（osteopontin，OPN）mRNA表达。

1.3 稳定敲低CHI3L1的慢病毒载体感染hUC-MSC和鉴定

构建含有shCHI3L1基因序列（ACCCACAT⁃CATCTACAGCTTT）和对照基因序列（TTCTCC⁃GAACGTGTCACGT）及绿色荧光蛋白（green fluo⁃rescent protein，GFP）基因和嘌呤霉素抗药基因的慢病毒载体（shCHI3L1）和对照载体（shNC）并收获慢病毒。将培养的P3 代hUC-MSC 按每孔1×105接种于6 孔板，分为细胞对照组、shNC-MSC 组和shCHI3L1-MSC 组，shNC-MSC 组和shCHI3L1-MSC 组感染病毒载量均为1×1010L-1，病毒感染复数（MOI）=10；细胞对照组未加慢病毒悬液。感染24 h 后，各组弃原培养基，更换为α-MEM 完全培养基（含10%胎牛血清），并进行嘌呤霉素抗药基因的筛选，嘌呤霉素浓度为2 mmol·L-1。筛选72 h，待细胞对照组无存活细胞，shNC-MSC 和shCHI3L1-MSC 组更换为α-MEM 完全培养基（含10%胎牛血清）培养并扩增细胞。

设hUC-MSC 细胞对照组，将hUC-MSC，shNC-MSC 和shCHI3L1-MSC 培养至融合度约80%，倒置显微镜下观察细胞形态；荧光显微镜观察GFP 表达；流式细胞术检测GFP+细胞百分率，鉴定转染效率；收集各组细胞分别提取总RNA和蛋白质，RT-qPCR 和Western 印迹法检测CHI3L1 mRNA和蛋白表达。

1.4 吉姆萨染色鉴定hUC-MSC，shCHI3L1-MSC和shNC-MSC细胞形态［13］

P2 代hUC-MSC 或P3 代hUC-MSC，shNCMSC 和shCHI3L1-MSC 接种于75 cm2细胞培养瓶中，培养至细胞融合度约80%，用0.125%胰蛋白酶消化细胞，离心（110×g，10 min），细胞计数；取3×105细胞接种于35 mm平皿中培养，细胞融合度约80%时进行吉姆萨染色并拍照。

1.5 流式细胞术检测hUC-MSC，shNC-MSC 和shCHI3L1-MSC表面标志物

收集P2 代或P3 代hUC-MSC，shNC-MSC 和shCHI3L1-MSC，制备成单细胞悬液，每管200 μL，加流式抗体（FITC-抗人CD14/APC-抗人CD14、PE-抗人CD73、FITC-抗人CD34/APC-抗人CD34、PE-抗人CD90、FITC-抗人CD45/APC-抗人CD45或PE-抗人CD105）避光孵育30 min；用1 mL PBS洗2次，加PBS 400 μL重悬细胞，于流式细胞仪检测。

1.6 RT-qPCR检测相关基因mRNA表达水平

TRIzol 法提取细胞RNA，测定RNA 浓度，逆转录合成cDNA，程序为70 ℃，10 min；42 ℃，1 h；70 ℃，15 min。以Master Mix、双蒸水、cDNA和引物配制qPCR 体系，每管20 μL，置qPCR 仪进行扩增，反应程序为预变性：95 ℃10 min；95 ℃15 s，60 ℃1 min，共40 个循环；检测CHI3L1，ADI，PPAR-γ，ALP和OPNmRNA 表达。2-△△Ct表示待测基因mRNA相对表达水平。

1.7 Western印迹法检测CHI3L1蛋白表达水平

用含蛋白酶、磷酸酶抑制剂的RIPA 裂解液裂解细胞团沉淀，离心取蛋白上清液并定量，加入25%蛋白体积比的5×SDS 缓冲液，99 ℃煮沸10 min；制备10%胶板，分别加入各组蛋白样品（20 μg），SDS-PAGE凝胶电泳约90 min；60 V转膜180 min；PVDF 膜置5%脱脂奶粉封闭1 h，分别与兔抗人CHI3L1 单抗和小鼠抗人GAPDH 单克隆抗体孵育12 h；TBST 洗3 次，与山羊抗兔或山羊抗小鼠IgG抗体（二抗）孵育1 h，TBST 洗3 次，显影，拍照，用Image J 软件分析蛋白条带积分吸光度值。CHI3L1 蛋白表达水平用CHI3L1 条带与GAPDH条带积分吸光度比值表示。

1.8 统计学分析

2 结果

2.1 hUC-MSC的鉴定

显微镜下观察，培养的hUC-MSC 呈均一的长梭形、漩涡状贴壁生长；经吉姆萨染色，可见细胞核呈圆形或椭圆形（图1A）。流式细胞术检测细胞表型结果表明，hUC-MSC 高表达CD73，CD90 和CD105，不表达或低表达CD14，CD34 和CD45（图1B）。油红O染色结果显示，hUC-MSC经成脂诱导分化后，诱导组细胞出现红色花环样脂滴（图1C1）；RT-qPCR 检测结果表明，诱导组成脂分化关键转录因子ADI和PPAR-γmRNA 相对表达显著高于细胞对照组（P<0.01）（图1C2）。hUC-MSC 经成骨诱导分化后，ALP 染色结果显示，细胞内ALP活性明显高于细胞对照组（图1D1）；RT-qPCR检测结果表明，诱导组成骨分化关键转录因子ALP和OPNmRNA 表达亦明显高于细胞对照组（P<0.01）（图1D2）。上述结果提示，培养的hUC-MSC 符合国际认证的MSC评判标准［14］。

Fig.1 Identification of cultured human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells（hUC-MSCs）. A：Giamsa staining，cell morphology observed under a microscope；B：cell phenotype examined by flow cytometry；C：adipogenic differentiation ability detected by oil red O staining（C1）and RT-qPCR（C2）；D：osteogenic differentiation ability assessed by ALP staining（D1）and RT-qPCR（D2）.±s，n=3.＊＊P<0.01，compared with cell control group.

2.2 shCHI3L1-MSC的鉴定

2.2.1 慢病毒感染hUC-MSC的效率

慢病毒感染hUC-MSC 并培养8 d，倒置显微镜下观察可见，hUC-MSC，shNC-MSC 和shCHI3L1-MSC均呈均一的长梭形、纤维样且漩涡状贴壁生长（图2A）。荧光显微镜下观察可见，shNC-MSC 和shCHI3L1-MSC 出现大量绿色荧光，而hUC-MSC未见荧光（图2B）。流式细胞术检测转染效率，未转染病毒的hUC-MSC 组GFP+细胞百分率为（1.8±1.2）%，shNC-MSC 组为（90.1±4.4）%，shCHI3L1-MSC组为（92.7±1.4）%（图2C）。

Fig.2 Efficiency of lentivirus transfection for hUC-MSCs and CHI3L1 mRNA and protein expressions in shNC-MSCs and shCHI3L1 MSCs. A lentiviral vector (shCHI3L1) containing shCHI3L1 gene sequence, fluoresecent protein (GFP) of gene and purinomycin resistance gene and control vector (shNC) was constructed and transfected with P3 generation HUC-MSCs. After 72 h filtration and using puromycin (2 mmol·L-1) resistance gene , shNC-MSCs and shCHI3L1-MSCs were obtained. A: morphology observed under a inverted microscope;B:GFP expression cells identified by a fluorescent microscope;C:GFP+cell percent assessed by flow cytometry;D: the mRNA expression of CHI3L1 analyzed by RT-qPCR；E: the protein expression of CHI3L1 detected by Western blotting. ±s, n=3.＊＊P<0.01,compared with sh-NC-MSC group.

2.2.2 shCHI3L1-MSC 中CHI3L1 mRNA 和蛋白表达

RT-qPCR 结果显示，shCHI3L1-MSC 中CHI3L1mRNA 表达显著低于hUC-MSC 和shNC-MSC（图2D）。Western 印迹法结果表明，与hUC-MSC 和shNC-MSC 相比，shCHI3L1-MSC CHI3L1 蛋白表达明显降低（图2E）。以上结果提示，带有shCHI3L1敲减序列的慢病毒可高效感染hUC-MSC，且可有效敲低CHI3L1在hUC-MSC的表达。

2.2.3 shNC-MSC和shCHI3L1-MSC生物学特性

经慢病毒转染的shNC-MSC 和shCHI3L1-MSC 在形态上仍呈长梭形、漩涡状贴壁生长（图3A）。流式细胞术检测细胞表型结果显示，其高表达CD73，CD90 和CD105，不表达或低表达CD14，CD34 和CD45（图3B）。shNC-MSC 和shCHI3L1-MSC体外成脂诱导分化培养14 d，油红O染色结果显示，细胞对照组未见红色脂滴，诱导组可见较多的红色脂滴（图4A1）；RT-qPCR检测结果显示，诱导组成脂关键转录因子ADI和PPAR-γmRNA表达水平显著高于细胞对照组（P<0.01）（图4A2）。shNCMSC 和shCHI3L1-MSC 成骨诱导分化培养12 d，ALP 染色结果表明，诱导组ALP 活性明显高于细胞对照组（图4B1）；RT-qPCR检测结果显示，诱导组成骨关键转录因子ALP和OPNmRNA 表达水平显著高于细胞对照组（P<0.05，P<0.01）（图4B2）。

Fig.3 Morphology and phenotype of shNC-MSCs and shCHI3L1-MSCs. A: Giemsa staining，morphology observed under a microscope；B:the phenotype assessed by flow cytometry.

Fig.4 Adiopogentic（A）and osteopogentic（B）differentiation abilities of shNC-MSCs and shCHI3L1-MSCs. A1：oil red O staining；A2：expression of PPAR-γ and ADI mRNA；B1：ALP staining；B2：expression of OPN and ALP mRNA. ±s，n=3.＊P<0.05，＊＊P<0.01，compared with cell control group.

2.3 shNC-MSC 和shCHI3L1-MSC 成脂分化能力的差异

将shNC-MSC 和shCHI3L1-MSC 进行成脂诱导分化14 d，油红O 染色结果显示，shNC-MSC 和shCHI3L1-MSC 诱导组均有脂滴出现，shCHI3L1-MSC 组脂滴数量明显多于shNC-MSC 组（图5A1）。经Image J 统计脂滴数目，shCHI3L1-MSC诱导组明显多于shNC-MSC 诱导组（P<0.01）（图5A2）；RT-qPCR 检测结果显示，两诱导组PPAR-γ和ADImRNA 表达均高于细胞对照组（P<0.01），shCHI3L1-MSC 诱导组PPAR-γ和ADImRNA 表达明显高于shNC-MSC 诱导组（P<0.01）（图5B1 和B2）。以上结果表明，敲低CHI3L1后hUC-MSC 成脂分化能力增强，CHI3L1 可抑制hUC-MSC 成脂分化。

Fig.5 Comparison of adipogentic ability in shNC-MSCs and shCHI3L1-MSCs. A1: oil red O staining; A2: the number of lipid droplets analyzed by Image J; B1 and B2: expressions of PPAR-γ and ADI mRNA，respectively. ±s, n=3. ＊＊P<0.01,compared with cell control group；##P<0.01，compared with shNC-MSC induced group.

2.4 shNC-MSC 和shCHI3L1-MSC 成骨分化能力的差异

将shNC-MSC 和shCHI3L1-MSC 进行成骨诱导分化12 d，ALP 染色结果显示，两诱导组ALP 活性明显高于细胞对照组（P<0.01），而shCHI3L1-MSC 诱导组明显低于shNC-MSC 诱导组（P<0.01）（图6A1 和A2）；RT-qPCR 检测结果（图6B1 和B2）显示，两诱导组成骨分化关键转录因子OPN和ALPmRNA 表达明显高于细胞对照组（P<0.01），shCHI3L1-MSC诱导组亦明显低于shNC-MSC诱导组（P<0.01）。以上结果表明，敲低CHI3L1后hUC-MSC成骨分化能力降低，CHI3L1 可增强hUC-MSC 成骨分化。

Fig.6 Comparison of osteogenic ability in shNC-MSCs and shCHI3L1-MSCs. A1：ALP staining；A2：ALP activity analyzed by Image J；B1 and B2：expressions of OPN and ALP mRNA，respectively. ±s，n=3. ＊＊P<0.01，compared with cell control group；##P<0.01，compared with shNC-MSC induced group.

3 讨论

MSC 的定向分化能力是其发挥组织修复与再生作用的重要基础。在MSC 分化过程中，成骨分化与成脂分化呈负相关性，正常生理状态下MSC成脂与成骨分化处于动态平衡状态。临床研究表明，当机体发生诸如卵巢功能低下或大剂量糖皮质激素导致的股骨头坏死或老年性骨质疏松等疾病时，MSC 功能明显下降，其增殖活性和分化能力明显降低［15］。此时外源性应用MSC 或通过诱导自身MSC增强成骨分化且抑制成脂分化，将有助于机体骨骼重建和恢复。因此，阐明MSC 向成骨和成脂细胞分化的调控机制可为此类疾病的治疗提供新的治疗策略。以往对MSC 成骨和成脂定向分化的研究主要关注改变各种因子、药物种类或调整诱导剂各成分浓度等［16］。在MSC 诱导分化过程中，当地塞米松使用浓度>1×10-8mol·L-1时，可使成骨分化关键转录因子Runx2（Runt-related transcrip⁃tion factor 2）表达显著降低，进而显著抑制MSC 成骨分化。同时，由于成骨分化能力降低，又促进成脂关键转录因子PPAR-γ 和C/EBP 表达，进而促进MSC成脂分化。因此，选择诱导剂的合适浓度对有效控制MSC定向分化至关重要。

MSC 向成骨和成脂细胞分化是一个精细而复杂的过程，需要多种转录因子和多个信号通路参与调控［17］，具体机制尚不十分清楚。目前关于某一特定基因对MSC 成脂和成骨定向分化调控的研究少有报道。本研究观察CHI3L1 对hUC-MSC 成脂和成骨分化平衡的调控作用。首先，利用慢病毒载体稳定敲低hUC-MSC 中的CHI3L1基因，验证其对hUC-MSC 生物学特性和诱导分化能力的影响。结果表明，敲低CHI3L1的hUC-MSC 即shCHI3L1-MSC 仍具有成脂和成骨分化能力。体外成脂和成骨诱导分化过程中，shCHI3L1-MSC 形成的红色脂滴和ALP 活性均高于未诱导组，且成脂分化关键转录因子PPAR-γ和ADImRNA 表达及成骨分化关键转录因子ALP和OPNmRNA 表达均显著高于未诱导组。

研究表明，Wnt信号通路在MSC成脂和成骨分化平衡调控中发挥重要作用，激活的Wnt 信号通路可促进MSC 成骨分化并抑制其成脂分化［18］。在MSC 的培养基内加入Wnt 信号传导抑制剂Dick⁃kopf-1 后，调控成骨分化的关键转录因子Runx2和ALPmRNA 表达水平显著降低，同时成脂分化关键转录因子PPAR-γmRNA 表达显著升高［19］。此外，CHI3L1可激活Wnt/β连环蛋白（catenin）信号通路，并通过IL-13/Rα2 依赖性机制调节氧化损伤、细胞凋亡、抗菌反应及黑色素瘤转移［20］。本研究结果表明，shCHI3L1-MSC 成脂诱导分化后，红色脂滴数目及成脂分化关键转录因子PPAR-γ和ADImRNA 表达显著高于shNC-MSC；而成骨诱导分化后，其ALP 活性及成骨分化关键转录因子OPN和ALDmRNA 表达明显低于shNC-MSC。由此提示，CHI3L1可能通过Wnt/β连环蛋白信号通路调控hUC-MSC成脂和成骨分化平衡。

综上，本研究结果表明，CHI3L1参与hUC-MSC的分化调控，抑制其成脂分化，促进其成骨分化。将CHI3L1 作为调控MSC 成脂分化及多向分化的新靶点进行后续研究，将为MSC治疗成脂与成骨平衡失调所导致的骨关节炎、骨折不愈合、原发和继发性骨质疏松等多种骨代谢相关疾病及脂肪组织移植提供实验依据，且有助于提高MSC治疗的精准性和靶向性。