微管马达驱动蛋白4A在胃癌中表达水平及其与预后关系

王 立, 谢 静, 宋 毅, 谢 鹏, 贺小武, 余力栋, 严 烁, 周建平

1.联勤保障部队第九〇六医院 普通外科,浙江 宁波 315040;2.宁波美晶医疗技术有限公司,浙江 宁波 315040

胃癌是常见的消化系统恶性肿瘤之一,截止2021年,胃癌在世界范围内发病率位于肿瘤的第5位,病死率高居肿瘤第4位,中国是胃癌大国,每年新发胃癌病例全球第一,几乎占到全球每年新发病例的50%[1]。由于缺乏早期特异性症状,且早期筛查率低,我国胃癌患者预后更差[2-3]。近年来,随着分子生物学检测的发展,胃癌的诊断及预后评估已不仅仅局限于组织学[4],找出对胃癌的诊断及预后评估具有意义的新分子生物学标记物非常重要。微管马达驱动蛋白4A(KIF4A)属于kinesin-4家族成员,其在有丝分裂中通过参与染色质的浓缩及分离、纺锤体的分离及细胞质的移动对真核细胞有丝分裂的管控、调节起着重要作用[5]。KIF4A表达异常已在多种人类癌症细胞中被发现[6-7]。江涛等[6]发现,KIF4A在结直肠癌中高表达,且与直肠癌转移相关。Wang等[7]研究报道,KIF4A与阿霉素诱导的乳腺癌细胞凋亡相关,影响乳腺癌患者预后。本研究旨在探讨KIF4A在胃癌组织中的表达水平及其与预后的关系。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 研究对象 将联勤保障部队906医院自2021年6月至2022年5月收治的接受手术治疗的19例胃癌患者纳入A组。把患者术中切下的新鲜胃癌组织及相应癌旁正常组织(距离肿瘤>5 cm)加入RNA保存液中,置入-80℃冰箱存放,采用实时荧光定量聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)检测。再将本院自2006年5月至2015年4月收治的接受手术治疗的103例胃癌患者纳入B组,通过手术获得103例石蜡包埋胃癌样本,通过胃镜获得35例正常组织样本。将B组样本制成组织芯片,采用免疫组化二部法染色方法进行染色,并由病理医师确认结果。两组患者术前均未接受放疗、化疗,且未合并其他恶性肿瘤。患者及其家属均签署知情同意书。本研究经医院伦理委员会批准。

1.2 主要试剂与仪器 RNeasy Plus Mini Kit、QuantiTect Reverse Transcription Kit(德国QIAGEN 公司),Power SYBRTM Green PCR预混液、7500实时荧光PCR仪(美国 Applied Biosystems公司),KIF4A和GAPDH基因引物(上海生工公司),一抗、KIF4A 抗体(武汉ABclonal 公司),兔二抗、DAB显色试剂盒(上海碧云天公司),CX43生物显微镜(日本Olympus公司)。

1.3 RNA提取及实时荧光定量PCR 按照产品说明书使用RNeasy Plus Mini Kit对19对新鲜样本进行RNA提取,以此为逆转录模板生成cDNA。KIF4A扩增的正向引物为5′-AAACGCCATCTGAATGACCTC-3′,反向引物为5′-CGAAACTTGACCACGCACT-3′。GAPDH作为同一个定量PCR反应中的内参,其正向引物为5′-TCTGACTTCAACAGCGACACC-3′,反向引物为5′-TGTTGCTGTAGCCAAATTCGTT-3′。扩增条件:1个预变性阶段(95℃,5 min)和40个循环的扩增定量阶段(95℃,15 s;60℃,45 s)。每个样本的实验均需重复3次。Ct表示目的基因的荧光值设定的阈值时反应循环数。采用公式△△Ct=△Ct(肿瘤样本)-△Ct(对照样本)计算每个肿瘤样本对于正常对照样本目的基因的相对Ct值差异。

1.4 组织芯片免疫组化分析 对4 μm厚的组织芯片样本进行脱蜡、水化、柠檬酸抗原修复,加内源性过氧化酶阻断剂,加KIF4A一抗(1∶100)过夜,加兔二抗,DAB显色,苏木精复染,封片。实验中阴性对照使用PBS代替一抗进行苏木精染色。结果由两名病理科医师进行判读。评分标准:染色面积0～3分,未着色0分,面积<25% 1分,25%～75% 2分,面积>75% 3分;染色强度0～3分,未着色0分,淡黄色1分,黄色2分,棕色3分。以染色面积与染色强度的乘积为最终评分,按最终评分将样本分为阴性组(评分<3分)和阳性组(评分≥3分)。

1.5 统计学方法 采用SPSS 23.0统计学软件对数据进行处理。计数资料以例(百分率)表示,组间比较采用χ2检验或Fisher精准概率法。生存曲线以Kaplan-Meier评估,比较采用log-rank检验。采用单因素和多因素Cox比例风险回归模型预测生存时间。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 KIF4A mRNA在胃癌组织及相应癌旁正常组织中mRNA水平比较 在A组的19对样本中,13例胃癌组织中的KIF4A mRNA水平低于其相应癌旁正常组织。见图1。

图1 A组19对样本KIF4A mRNA表达量差(肿瘤组织-正常组织)

2.2 胃癌和正常组织样本中KIF4A蛋白阳性率比较 KIF4A蛋白主要表达于细胞质。B组103例胃癌组织样本的KIF4A蛋白阳性率为58.3%(60/103),35例正常组织样本的KIF4A蛋白阳性率为80.0%(28/35)。胃癌组织样本的KIF4A蛋白阳性率低于正常组织样本,差异有统计学意义(P<0.05)。见图2。

图2 B组胃癌和正常组织免疫组化染色图片(a.胃癌组织,IHC×100;b.胃癌组织,IHC×400;c.正常组织,IHC×100;d.正常组织,IHC×400)

2.3 KIF4A表达与临床病理特征关系 KIF4A与胃壁浸润深度、TNM分期相关(P<0.05)。见表1。

表1 KIF4A表达与临床病理特征关系/例(百分率/%)

2.4 KIF4A表达对胃癌患者生存时间影响Kaplan-Meier曲线 以电话或门诊形式对B组患者进行随访,随访至2022年12月,随访率为100.0%(103/103)。随访中,49例患者死亡,中位生存时间为58个月。KIF4A阴性组患者总生存时间短于KIF4A阳性组患者,差异有统计学意义(P<0.05)。见图3。

图3 KIF4A表达对胃癌患者生存时间影响Kaplan-Meier曲线

2.5 胃癌患者生存时间影响因素分析 在单因素Cox风险回归模型中,KIF4A表达水平、TNM分期、分化程度、胃壁浸润深度、淋巴结转移与生存时间相关(P<0.05)。为校正上述结果,将单因素分析中的阳性因素纳入多因素Cox回归,结果提示,KIF4A表达水平、TNM分期、分化程度可以作为胃癌的预后影响因子(P<0.05)。见表2。

表2 胃癌患者生存时间影响因素分析

3 讨论

KIF4A最早在小鼠的中枢神经系统中被发现,其在神经细胞的物质转运中发挥作用[8]。KIF4A的异常表达与多种疾病相关,如艾滋病毒感染[9]、阿尔茨海默病[10]及多种癌症(包括口腔癌[11]、骨肉瘤[12]、胰腺导管腺癌[13]、肝癌[14]、肾透明细胞癌[15]、子宫癌[16]、肠癌[17])等。KIF4A在肿瘤中的表达似乎具有两面性,其低表达或过表达均可能抑制癌细胞的增殖或迁移。例如:KIF4A在肝癌和宫颈癌组织中的表达水平明显高于癌旁组织[18-19],乙型肝炎病毒可能激活KIF4A基因启动子,上调KIF4A mRNA和蛋白表达,最终导致肝癌发生[14];而另一方面,KIF4A在多发性骨髓瘤和急性髓系白血病[20]中表达显著降低,骨肉瘤中的KIF4A表达增加也会显著抑制肿瘤生长[12],有动物实验发现,基因敲除KIF4A可引起小鼠胚胎干细胞非整倍体发生,最后导致裸鼠体内形成肿瘤[21]。这可能与KIF4A在不同肿瘤中具有不同的调节机制有关[22]。

有研究报道,KIF4A的表达可抑制胃癌细胞系增殖[23]。本研究首先通过荧光定量PCR发现胃癌组织中的KIF4A mRNA水平低于其相应癌旁正常组织,然后再通过免疫组化染色方法发现组织芯片中胃癌组织样本的KIF4A蛋白阳性率低于正常组织样本,进一步结合临床病理特征分析发现KIF4A与胃壁浸润深度、TNM分期相关,最后在多因素分析中发现KIF4A表达水平、TNM分期、分化程度可以作为胃癌的预后影响因子。胃癌患者KIF4A低表达与不良预后相关可能是由于KIF4A缺失会导致有丝分裂缺陷,包括染色体过缩、纺锤体异常形成、后期桥、细胞质分裂缺陷和非整倍体产生[24]。上述问题中的任何一个均可能会激活有丝分裂检查点和DNA损伤反应途径。尽管大部分有丝分裂缺陷细胞会通过凋亡或细胞周期阻滞被消灭,但仍有少部分基因缺陷会逃脱这些检查点,最终促进肿瘤的发生和发展[25]。

综上所述,KIF4A表达水平与胃癌恶性程度呈负相关,其低表达提示预后不良。随着研究的深入,KIF4A可能有助于胃癌治疗领域新靶点的发现。