黑曲霉固态发酵葡萄皮渣产木聚糖酶的工艺研究

■ 王 静 董梦蝶 李 祥 侯文静 潘春梅

（河南牧业经济学院食品与生物工程学院（酒业学院），河南郑州 450046）

近年来，随着葡萄酒产业的快速发展，葡萄皮渣 的排放量逐年增加，而被回收再利用的皮渣量仅占总量的25%，大部分被用作饲料、肥料甚至丢弃，造成了资源浪费和环境污染[1-2]。木聚糖酶是一种半纤维素酶，通过破碎植物细胞壁，使营养物质得到释放，还能改善纤维素酶的酶解率，进而降低纤维素酶的应用成本[3-5]。黑曲霉是一种常见的无毒性曲霉属真菌，常用来生产纤维素酶、单宁酶、木聚糖酶等，在酶制剂生产、污水处理及有机酸发酵等方面,均被用作发酵微生物而被广泛使用[6-7]。

葡萄皮渣中含有原花青素、葡萄籽油及白藜芦醇等有益物质[8]。国内外有以葡萄皮渣为原料，以黑曲霉为生产菌株产果胶酶和纤维素酶的工艺研究，但以葡萄皮渣为底物，黑曲霉为发酵菌株产木聚糖酶的工艺未见有报道[9]。因此，探索以黑曲霉为菌种发酵葡萄皮渣生产木聚糖酶的工艺，具有一定的经济价值和社会效益。文章通过单因素试验和响应面优化利用黑曲霉发酵葡萄皮渣生产木聚糖酶的最佳工艺，为葡萄皮渣的资源化利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

菌种黑曲霉，为本实验室保藏。葡萄皮渣购于河南唐僧寺酒堡有限公司，粉碎并过50 目筛备用，硫酸锰、七水硫酸锌、硫酸铵、磷酸二氢钾、硫酸亚铁和七水硫酸镁等试剂均为分析纯，购于国药集团化学试剂有限公司。

1.2 主要仪器与设备

H1650 台式高速离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；KD-LS霉菌培养箱，广州番禺旭东阪田电子有限公司；FA1104 分析天平，上海舜宇恒平科学仪器有限公司；LDZX-50KCS高压灭菌锅，上海审安医疗器械服务有限公司；722S可见分光光度计，上海菁华科技仪器有限公司；PHS-3CpH 计，海佑科仪器仪表公司；8002水浴锅，姜堰市天力医疗器械有限公司。

1.3 培养基

马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）：购于杭州百思生物技术有限公司。

发酵产酶培养基：葡萄皮渣16.0 g，磷酸二氢钾1.2 g，硫酸铵1.2 g，七水硫酸镁0.6 g，微量元素1 mL（微量元素：硫酸亚铁5.0 mg、硫酸锰1.6 mg、七水硫酸锌1.4 mg，定容至1 000 mL）初始含水量55%，起始pH为7.0。

1.4 方法

1.4.1 单因素试验以木聚糖酶活性作为检测指标，黑曲霉接种量15%，发酵时长72 h，初始pH 7，初始含水量55%，料层厚度2.5 cm 为固定值，依次考察黑曲霉接种量（5%、10%、15%、20%、25%）、发酵时长（36、48、60、72、84 h）、初始pH（5、6、7、8、9）、初始含水量（45%、50%、55%、60%、65%）和料层厚度（2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 cm）对木聚糖酶活性的影响[11-12]。

1.4.2 响应面优化

在单因素试验基础上，选取初始pH（A）、黑曲霉接种量（B）、发酵时长（C）3 个因素，进行3 因素3 水平的Box-Benhnken 试验设计，以木聚糖酶活性为主要响应值，进行响应面分析，优化产木聚糖酶发酵工艺[13-14]。响应面试验因素水平见表1所示。

表1 响应面试验Box- Behnken因素水平

1.4.3 木聚糖酶活性的测定

精确称取木聚糖1.000 0 g(精确到0.000 1 g)于小烧杯中，用约80 mL pH 5.0 的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液溶解，完全溶解后用缓冲溶液定容至100 mL 的容量瓶中，4 ℃贮存备用。

准确吸取配制好的1.8 mL 1%的木聚糖溶液加入到25 mL 的具塞试管中，在50 ℃水浴锅中恒温反应5 min 后，添加稀释过后的粗酶液0.2 mL，50 ℃水浴锅中反应15 min 后立即加入1.5 mL DNS 试剂，震荡混匀后沸水浴5 min，用自来水冷却至室温后用蒸馏水定容至25 mL。以灭活的粗酶液为空白对照，按序在540 nm波长下测吸光值[15-16]。

酶活性单位的定义为：以木聚糖为底物，每分钟释放1 μmol 相当于木糖的还原糖所需的酶量为一个酶活单位（U）。

2．3 农村留守儿童社会适应得分与其心理韧性得分的相关性 农村留守儿童社会适应各维度得分与其心理韧性各因子得分大都存在显著负相关。见表3。

式中：W——酶解反应产生的木糖量（mg），从木糖标准曲线上查得；

N——酶液稀释倍数；

M——木糖分子量（g/mol），150.13 g/mol；

T——反应时间（min），15 min；

V——酶用量（mL），0.2 mL。

1.5 数据处理与分析

所有试验均设置3 个重复，用“平均值±标准差”表示，用Origin Pro 2021 作图，Design-Expert 8.0 软件进行数据处理和分析。P＜0.05为差异显著，P＜0.01为差异极显著。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

由图1A、1B、1D 可知，随着初始pH、黑曲霉接种量和初始含水量的增加，木聚糖酶活性呈现先升高后降低的趋势，当初始pH 为7 时，木聚糖酶的活性达到最高为119.29 U/g。当黑曲霉的接种量为10%时，木聚糖酶活性达到最高为147.15 U/g。初始含水量为50%时，木聚糖酶的活性达到最高为108.95 U/g。因此，选取黑曲霉接种量为10%、初始pH 为7 和含水量为50%作为木聚糖酶发酵工艺条件。由图1C 可知，木聚糖酶的活性刚开始变化不明显，随着发酵时长的增加，木聚糖酶的活性逐渐增加，当培养时间达到60 h 时，木聚糖酶的活性达到最高为125.45 U/g。当超过60 h后，木聚糖酶的活性呈现下降的趋势。由图2 可知，料层厚度对木聚糖酶活性影响并不大，当料层厚度为2.5 cm 时，木聚糖酶的活性达到最高值46.08 U/g，之后随着料层厚度的增加，木聚糖酶的活性逐渐趋于平稳。

图1 初始pH、黑曲霉接种量、发酵时长和初始含水量对木聚糖酶活性的影响

图2 料层厚度对木聚糖酶活性的影响

2.2 Plackett-Burman试验

根据影响黑曲霉固态发酵葡萄皮渣产木聚糖酶的单因素结果分析，选取初始pH、黑曲霉接种量、发酵时长、初始含水量和料层厚度5 个因素进行Plackett-Burman试验（PB试验），筛选出对黑曲霉固态发酵葡萄皮渣产木聚糖酶活性影响显著的3个因素进行响应面分析。试验设计与结果如表2和表3所示。

表2 Plackett-Burman试验设计因素水平

表3 Plackett-Burman试验设计与结果

PB 试验设计的回归方程方差分析以及影响因子的显著性分析结果如表4所示。由表4可知，5个因素对黑曲霉固态发酵葡萄皮渣产木聚糖酶影响的重要性排序为：C＞B＞A＞D＞E，即发酵时长＞黑曲霉接种量＞初始pH＞初始含水量＞料层厚度。因此，选取发酵时长、黑曲霉接种量、初始pH 三个因素进行响应面分析优化。

表4 各因素主效应分析

2.2.1 响应面试验因素分析结果

依据Box-Benhnken 设计试验，运用Design-Expert 8.0 对A（初始pH）、B（黑曲霉接种量）和C（发酵时长）3个因素进行响应面分析试验设计3因素3水平包括5个中心点共17个试验，结果如表5所示。

表5 响应面试验设计与结果

2.2.2 响应面试验结果及方差分析

运用Design-Expert8.0软件对数据展开分析，获得如下二次多项回归方程：R=247.79+3.99A-0.28B-6.73C+10.83AB-4.33AC-18.76BC-26.63A2-33.26B2-25.33C2，并作方差分析。结果如表6 所示，模型的F=235.46，P＜0.00 01，差异极显著，而且失拟项P=0.995 2＞0.05，因而该模型是显著的。且R2=0.9967，AdjR2=0.992 5，PreR2=0.963 3，方差相差很小，且接近1，表明拟合程度极好，可以用此模型来分析和预测木聚糖酶的最优提取工艺。

表6 二次多项模型及各项的方差分析

由表6 可知，初始pH 和黑曲霉接种量对黑曲霉固态发酵葡萄皮渣产木聚糖酶的影响显著（P＜0.05），发酵时长对木聚糖酶影响极显著（P＜0.01），三个因素对木聚糖酶活性的影响程度为C＞A＞B。对交互作用来说，初始pH 和黑曲霉接种量的交互作用对木聚糖酶的影响极显著（P＜0.01），培养基初始pH 和发酵时长的交互作用对木聚糖酶的影响显著（P＜0.05），黑曲霉接种量和发酵时长对木聚糖酶活性影响极显著（P＜0.01）。

2.2.3 各因素交互作用响应面结果与分析

通过Design-Expert 8.0 软件获得二次响应面回归模型，并分析和创建相应的响应面。利用回归模型绘制的各因素交互作用的3D 响应面和等高线图如图3所示。

图3 各因素交互对木聚糖酶活性影响的响应面与等高线

等高线图中心的椭圆越趋近于圆，则表明其两两交互作用对木聚糖酶活性的影响越不显著，从等高线图中可以看出，初始pH 和黑曲霉接种量即AB的交互作用，黑曲霉接种量和发酵时长即BC的交互作用对木聚糖酶活性的影响极为显著。相比之下，培养基初始pH 和发酵时长即AC的交互作用对木聚糖酶活性的影响没有AB、BC对木聚糖酶活性的影响显著。从3D 响应面图中可以看出，当发酵时长固定不变时，随着培养基初始pH 的增大，木聚糖酶活性呈现先上升后下降的趋势；同样，当培养基初始pH固定不变时，随着发酵时长的延伸，木聚糖酶的活性也出现先上升后下降的现象。当木聚糖酶活性达到最大值时，培养基初始pH 为7，发酵时长为60 h 左右；培养基初始pH 和黑曲霉接种量的交互作用对木聚糖酶的影响同上，在培养基初始pH 为7 左右，黑曲霉接种量大约为10%时木聚糖酶活性达到最大值。黑曲霉接种量和发酵时长的交互作用中，当黑曲霉接种量为10%，发酵时长为60 h 左右时，木聚糖酶活性达到最大值。

根据响应面试验，确定最优工艺条件为：培养基初始pH为7.10，发酵时长为58.05 h，黑曲霉接种量为10.29%，在此条件下模型预测的木聚糖酶活性为248.529 U/g。

2.3 验证试验

将得到的最优组合根据实际试验条件调整为pH 7，发酵时长58 h，接种量10%进行验证试验，每组进行3 个平行试验，测得木聚糖酶的活性为246.98 U/g，实际数值与模型预测数值相近，验证了黑曲霉固态发酵葡萄皮渣产木聚糖酶的培养条件优化有效。

3 讨论

葡萄皮渣含有丰富的有益成分，通过微生物发酵，产生有益代谢物和酶类，从而对动物细胞具有特殊的促进作用[17-19]。因此，发挥葡萄皮渣的营养价值，实现糟渣资源的合理利用，其中发酵菌种选择和发酵工艺优化尤其重要[20]。黑曲霉国际公认的安全生产菌株，具有多种活性较强的酶系,是重要的酶制剂生产菌种,也是木聚糖酶的生产菌种之一[21]。

孔健等[22]在淀粉渣中获得了一株生理状态很好的黑曲霉（Aspergillus niger）SA7，其具有较高的木聚糖酶活性，在一定条件下进行培养优化工艺，检测其木聚糖酶活性高达2 400 U/g，且酶系组成完全。刘成等[23]采用单因素和正交试验，以棉粕和玉米秆为原料，对黑曲霉固态发酵产木聚糖酶的工艺条件进行了优化，结果发现，当培养基组成棉粕比玉米秆为3∶2，料水比为1∶1.2，尿素添加量为2%(以干重计)，磷酸二氢钾的添加量为0.2%时，木聚糖酶酶活性可达6 529 U/g 。王维超等[24]应用单因素试验和响应面法对黑曲霉固态发酵苹果渣生产木聚糖酶与β-甘露聚糖酶进行了研究，木聚糖酶的活性在5 736 U/g实现最高值。郑虹[14]利用稻谷壳为发酵底物，探索了黑曲霉产木聚糖酶的最优工艺，最终得到的酶活性稳定在221.5 U/g，相比优化之前提高了1.76 倍。周薇薇等[25]探索了黑曲霉作用于麸皮和大麦渣生产木聚糖酶的最佳工艺条件，得到木聚糖酶活性为66 002 U/g，较之单因素条件下所产酶的活性提高了114 U/g。

本试验测得发酵葡萄皮渣产木聚糖酶活性为246.98 U/g，与郑虹[16]研究结果基本一致，但由于作用基质不同，发酵工艺不同，测得的酶活性也不相同。本研究利用响应面法对葡萄皮渣进行黑曲霉固态发酵产木聚糖酶条件优化，确定了黑曲霉固态发酵葡萄皮渣产酶的最佳工艺条件。

4 结论

本试验以葡萄皮渣为原料，用黑曲霉发酵生产木聚糖酶，通过单因素试验和响应面优化得到最佳发酵条件为初始pH 为7、发酵时长为58 h、接种量为10%、初始含水量为60%、料层厚度为2.5 cm，在此条件下木聚糖酶活性最高为246.98 U/g，相比初始发酵条件下酶活性提高了179%。表明通过响应面法能够较好的优化产酶条件，为酶制剂的生产和葡萄皮渣的综合应用提供理论研究基础和思路。