2-溴乙胺减轻小鼠急性酒精性肝损伤

曹冬黎,黄瑶瑶

(1.安徽理工大学医学院,安徽 淮南 232001; 2.安徽理工大学安徽省职业健康安全工程实验室, 安徽 淮南 232001)

长期过量饮酒导致的肝细胞损伤、肝脂肪变性、肝炎、肝纤维化、肝硬化甚至肝癌等肝脏疾病,称为酒精性肝病(Alcoholic Liver Disease,ALD)[1]。严重酗酒可诱发广泛的肝细胞坏死,从而发生急性ALD。该病致死率、致残率较高,因此急性ALD的防治非常重要。

急性ALD的发生机制非常复杂,涉及乙醇代谢、炎症反应和氧化应激等。研究发现,急性ALD患者血液中谷丙转氨酶(alanine aminotransferase,ALT)、谷草转氨酶(aspartate aminotransferase,AST)和谷氨酰转肽酶(Glutamyl transpeptidase,GGT)含量急剧升高[2],肝脏丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量增加而超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和谷胱甘肽(glutathione,GSH)减少[3]。核因子-κB(nucleus factor-κB,NF-κB)信号途径激活,产生大量肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)等多种细胞因子、黏附分子、趋化因子以及诱导型一氧化氮合酶等[4],参与炎症反应,导致肝损伤的发生。ALD可促进高血压、糖尿病、肥胖等疾病的发生,并且这些患者血浆中氨基脲敏感性胺氧化酶(semicarbazide-sensitive amine oxidase,SSAO)的活性显著升高[5]。SSAO是由人类AOC3基因编码的含铜酶,研究发现SSAO在脂肪细胞高表达,其类胰岛素作用可促进葡萄糖转运[6],而血管内皮细胞表面SSAO参与调节淋巴细胞向炎症部位的黏附及迁移[7]。SSAO可以清除内源性和外源性的胺,并随之产生有毒性的甲醛、丙酮醛等毒性醛类、过氧化氢(hydrogen peroxide,H2O2)和氨,导致氧化应激反应的增加[8]。ALD的发生与炎症反应、氧化应激密切相关,患者体内出现糖代谢的异常,而具有胺氧化酶和黏附分子双重生物活性的SSAO是否参与ALD的发生以及作用途径尚不清楚。

本研究以AOC3基因敲低和非敲低HepG2细胞进行细胞实验,建立小鼠急性ALD模型进行动物实验,使用特异性SSAO抑制剂2-溴乙胺(2-bromoethylamine,2-BEA)[9]预处理小鼠模型,研究SSAO活性改变对急性酒精性肝损伤发生的影响及相关机制,探索减少肝脏损伤的可能策略。

1 材料与方法

1.1 材料

10周龄雄性SPF级C57BL/6J 小鼠购自中科院上海斯莱克动物中心;全自动生化分析仪(LABOSPECT003 型)购自日本日立公司;RNA干扰(RNAi)载体由厦门大学生命科学院提供;2-BEA购自美国Sigma公司;DMEM培养基干粉和胎牛血清购自美国Invitrogen公司;Triton-X 100购自Amresco;ALT、AST、MDA、SOD、GSH测定所需试剂盒购自南京建成生物工程研究所;H2O2、TNF-α ELISA试剂盒购自上海博士德;蛋白marker购自美国Bio-Rad公司;PVDF膜购自美国Millipore公司;NF-κB p65兔抗鼠一抗购自Santa Cruz生物技术公司;兔抗小鼠β-actin多克隆抗体购自北京博奥森生物技术有限公司;辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗购自武汉博士德公司;Western blot 荧光检测试剂盒购自北京中杉金桥公司;BCA蛋白含量测定试剂购自Amresco上海生工分装;其他试剂均为国产分析纯。

1.2 方法

1)AOC3敲低HepG2细胞的构建 设计短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)引物,PCR扩增反应后,通过琼脂糖凝胶电泳将PCR产物分离,回收目的DNA片段,将其与pLV-RNAi载体相连接;之后将连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中,并涂布在具有特定抗生素的LB平板上,待14～18h后,挑取单克隆菌落摇晃培养,采用碱裂解法提取质粒DNA并酶切鉴定转化子;采用磷酸钙转染法将构建好质粒转染到HepG2细胞,8～12h后更换新鲜培养液,24h后观察转染效率。逆转录聚合酶链反应鉴定AOC3基因敲低效果所用引物,人AOC3引物序列:上游 5’CCAAGGATCTTTGACGTTCGC 3’,反向引物5’CTCCATCCACATAGCGGGTC 3’,PCR扩增产物长度124bp。人β-actin引物序列:上游5’TCACCATCTTCCAGGAGCGAG 3’,下游 5’TGTCGCTGTTGAAGTCAGAG 3’,PCR扩增产物长度为539bp。

2)细胞培养和分组 细胞生长于含有10%胎牛血清的DMEM培养液中,37℃、5% CO2培养箱中静置培养。培养液中加10mmol/L HEPES、100IU青霉素和100mg/L链霉素,取对数生长期细胞进行实验。实验前无血清培养2h,然后加入不同处理因素,分为4组:①对照组(control)即不加处理因素培养细胞;②乙醇暴露组(Alcohol);③AOC3敲低组(L-A);④AOC3敲低后乙醇暴露组(LA-A)。乙醇暴露组加入50mmol/L乙醇处理细胞,12h后收集细胞,用四唑盐比色法检测细胞活性。

3)小鼠急性酒精性肝损伤模型的建立和分组 将60只10周龄雄性SPF级C57BL/6J小鼠分为5组,每组12只,实验前禁食12h。①对照(CON)组采取生理盐水(10ml/kg)一次性灌胃;②2-BEA单独处理(2-BEA)组采取2-BEA (200mg/kg)生理盐水(10ml/kg)灌胃前2h腹腔注射;③乙醇暴露(Alcohol)组采取50%乙醇(10ml/kg)一次性灌胃;④低剂量2-BEA治疗(L2-BEA)组采取腹腔注射20mg/kg 2-BEA 2h后,再以50%乙醇(10ml/kg)一次性灌胃;⑤高剂量2-BEA治疗(H2-BEA)组采取腹腔注射200mg/kg 2-BEA 2h后,再以50%乙醇(10ml/kg)一次性灌胃。各组中每6只按乙醇或生理盐水灌胃后0、2、4、6、8、10、12h时间点检测血糖;其余6只12h后摘眼球取血检测血脂、肝功能、血浆SSAO活性、血浆TNF-α和NO浓度;处死动物采集肝组织,一部分用液氮冻存,一部分用4%多聚甲醛固定,进行病理形态学等测定。

4)高效液相色谱法(HPLC)检测SSAO活性 检测方法根据文献[10]进行,收集细胞,PBS 洗3次,最后1次PBS 洗涤液作为空白对照,用超声细胞破碎仪破碎细胞;从小鼠眼球取血后经EDTA 抗凝、离心,之后血浆放入-80℃冻存。取200μL细胞悬液或200μL血浆,加入氯吉灵完全抑制单胺氧化酶活性;加入苯甲胺水浴,最后加入三氯乙酸终止反应;取上清液于5mL玻璃离心管,加入2,4-二硝基苯肼水浴;衍生化后的产物用乙酸乙酯萃取两次,45℃下N2吹干,干燥产物用乙腈-0.1%甲酸水溶液( 50∶50,v/v )溶解;采用HP1100 HPLC系统用于测定苯甲醛衍生物,色谱分离柱为 AgilentZorbax SB-C18 (5μm,150mm×2.1mm),检测波长为382nm,检测器为二极管阵列检测器。

5)ELISA检测细胞培养液和血清TNF-α水平 参照试剂盒说明书,分别将标准品和血清样本加至相应孔中孵育,除空白孔外均加入生物素化抗小鼠 TNF-α抗体或IL-1抗体工作液进行孵育,依次加入ABC工作液、TMB 显色液孵育,最后加入终止液,混匀后用酶标仪测量OD(450nm)值。根据标准曲线计算各样本中TNF-α浓度。

6)荧光分光光度计法检测H2O2水平 细胞接种于24孔板,每孔2×106个细胞;弃去培养液,PBS洗3次;加入50mmol/L乙醇处理细胞6h,同时加入2’,7’-dichlorofluorescein(DCFH) -diacetate(DA)作为检测 H2O2的探针[11],使每孔最终浓度为 15μM,37℃孵育1h,收集培养基上清;细胞PBS洗3次;0.1% v/v Triton-X-100裂解10min,收集裂解液;取血后静置、离心,常规分离血清;用荧光分光光度计(激发波长485nm/发射波长530nm)分别检测上清、细胞裂解液和血浆中H2O2的荧光强度。结果以处理组/阴性对照表示。

7)Western印迹检测蛋白质表达 肝组织和细胞裂解匀浆后提取细胞蛋白和核蛋白,在蛋白质样品中加入适量5×SDS上样缓冲液和10% β-巯基乙醇,100℃煮10min,6%或10%SDS-PAGE电泳后电转移至PVDF膜上,经丽春红染色后观察蛋白质转移情况。5%脱脂牛奶室温封闭4h,分别加入1∶200 SSAO一抗、1∶200 NF-κB p65一抗或者1∶2 000 β-actin一抗4℃孵育4～8h,TBST洗涤。加入1∶5 000辣根过氧化物酶标记的二抗,室温孵育2h,TBST洗涤。用Western印迹荧光检测试剂盒显示于X光片。结果用Labwork凝胶图像分析系统对胶片扫描,以对照组的面积灰度值为100%与实验组进行比较和半定量分析。

8)血葡萄糖检测 采用便携式血糖仪检测血葡萄糖浓度。

9)肝组织HE染色 取小鼠肝叶新鲜组织,常规制作石蜡切片进行HE染色,于400倍光学显微镜下观察肝细胞的形态变化、炎症反应、充血淤血等病理改变;使用Olympus摄像系统进行摄片和分析。

10)肝功能测定 取血后静置、离心,常规分离血清,用全自动生化分析仪检测血清ALT、AST、GGT等肝功能指标。

11)检测MDA、SOD和GSH 取少量肝脏左叶,制成10%肝匀浆,离心后取上清,放于-20℃冰箱中冷冻保存。按试剂盒说明采用分光光度计532nm 测OD值并计算肝匀浆中MDA、SOD和GSH的含量。

2 结果

2.1 AOC3基因敲低HepG2细胞构建

利用新型基因沉默载体RNA干扰(RNAi)载体pLV-RNAi,制备AOC3基因敲低的HepG2细胞,设计shRNA引物如图1(a)所示;RT-PCR鉴定细胞AOC3敲低效果如图1(b)所示,基因敲低后,AOC3 mRNA表达低于正常HepG2细胞;Western印迹检测AOC3敲低后HepG2细胞SSAO蛋白质表达低于正常HepG2细胞,如图1(c)所示。

(a)AOC3的shRNA引物结构

2.2 乙醇对各组细胞SSAO活性的影响

实验按照细胞分组进行,12h后收集细胞,采用四唑盐比色法检测细胞活性,结果发现,组间无显著差别;采用HPLC法检测细胞SSAO 活性,结果如图2所示,相对于control组,乙醇显著增加细胞SSAO活性(上调至约5倍)(P<0.05);L-A组与control组比较,SSAO活性无显著差异(P<0.05);LA-A组细胞SSAO活性高于control组(P<0.05)、低于Alcohol组(P<0.05)。由此可知,乙醇可以增加细胞SSAO活性,而AOC3基因敲低可以抑制此作用。

*表示P<0.05,与control组比较;#表示P<0.05,与L-A组比较

2.3 乙醇对各组细胞产H2O2的影响

实验按照细胞分组后,使用荧光分光光度计检测细胞内及培养基上清中H2O2含量,如图3所示,相对于control组,加入乙醇可显著增加细胞内及培养基上清中H2O2的含量(P<0.05);L-A组与control组H2O2的含量无显著差异(P<0.05);LA-A组细胞内及培养基上清中H2O2的含量高于control组(P<0.05),低于Alcohol组(P<0.05)。由此可知,加入乙醇可以促进细胞产生和释放H2O2,而AOC3基因敲低可以抑制此作用。

(a)细胞内H2O2水平 (b)培养基中H2O2水平

2.4 乙醇对各组细胞产生TNF-α的影响

实验按照细胞分组后,使用ELISA检测细胞培养基上清中TNF-α含量,如图4所示,control组、Alcohol组、L-A组与LA-A组细胞培养基上清中TNF-α含量无显著差异,说明乙醇或AOC3基因敲低对细胞培养基上清中TNF-α的水平无显著影响。

图4 AOC3基因敲低和乙醇对TNF-α的影响

2.5 乙醇对NF-κB p65蛋白质表达的影响

实验按照细胞分组后,使用Western印迹分析法(Western Blot,WB)检测细胞核内NF-κB p65蛋白质表达,如图5所示,control组、Alcohol组、L-A组与LA-A组细胞核内NF-κB p65蛋白质表达无显著差异,说明乙醇或AOC3基因敲低对细胞核内NF-κB p65蛋白质的表达水平无显著影响。

(a)Western Blot

2.6 2-BEA抑制急性ALD小鼠血糖变化

动物实验中使用葡萄糖氧化酶-过氧化物酶法检测小鼠血浆葡萄糖含量,如图6所示,相对于CON组,Alcohol组小鼠的血糖6h后显著上升,而12h后显著下降(P<0.05);相对于Alcohol组,L2-BEA组和H2-BEA组小鼠的血糖6h后显著降低,12h后血糖显著升高(P<0.05),但相对于CON组这两组小鼠的血糖6h后仍有显著增加(P<0.05),12h后仍有显著降低(P<0.05)。由此可知,2-BEA可以抑制急性酒精性肝损伤小鼠6h后高血糖和12h后低血糖。

*表示P<0.05,与CON组比较;#表示P<0.05,与Alcohol组比较

2.7 2-BEA减轻急性ALD小鼠肝组织损伤

实验使用HE染色法观察小鼠肝组织病理变化,染色结果如图7所示,CON组和2-BEA组小鼠肝小叶结构清晰,肝细胞呈条索状排列,肝窦结构完整;Alcohol组小鼠肝小叶界限模糊,肝细胞排列紊乱,出现明显的肝细胞肿胀,炎性充血淤血;L2-BEA 组和H2-BEA组小鼠的肝细胞肿胀、炎性充血淤血积明显改善。由此可知,2-BEA可以减轻乙醇诱导的肝组织急性病理学损伤。

2.8 2-BEA抑制急性ALD小鼠血浆SSAO活性

实验使用HPLC法检测小鼠血浆SSAO 活性,如图8所示,Alcohol组小鼠血浆SSAO活性相对于CON组显著增加(P<0.05);L2-BEA组和H2-BEA组小鼠血浆的SSAO活性相对于CON组显著增加(P<0.05),相对于Alcohol组显著降低(P<0.05)。由此可知,急性酒精性肝损伤使得小鼠血浆的SSAO活性增加,而2-BEA可以抑制乙醇的这种作用。

*表示P<0.05,与CON组比较;#表示P<0.05,与Alcohol组比较

2.9 2-BEA抑制急性ALD小鼠转氨酶的升高

实验使用全自动生化分析仪检测肝功能指标,结果如表1所示,Alcohol组小鼠血清ALT、AST、GGT含量相对于CON组增加(P<0.05);L2-BEA组和H2-BEA组小鼠血清ALT、AST、GGT含量显著高于CON组(P<0.05),但显著低于Alcohol组(P<0.05)。由此可知,急性酒精性肝损伤使得小鼠体内转氨酶升高,而2-BEA可以抑制乙醇的肝功能损伤作用。

表1 2-BEA减轻乙醇诱导的血清ALT、AST、GGT含量的升高 U·L-1

2.10 检测肝脏组织MDA、SOD和GSH

实验使用试剂盒检测肝匀浆MDA、SOD和GSH的含量结果如表2所示,Alcohol组相对于CON组小鼠肝脏MDA含量增加、SOD和GSH含量减少(P<0.05);L2-BEA组和H2-BEA组小鼠肝脏MDA含量显著高于CON组(P<0.05),显著低于Alcohol组(P<0.05),而肝脏SOD和GSH含量显著低于CON组(P<0.05),显著高于Alcohol组(P<0.05)。由此可知,乙醇诱导肝组织MDA含量增加、SOD和GSH消耗增加,而2-BEA可以减轻以上作用。

表2 2-BEA减轻乙醇诱导的血清MDA含量的升高和SOD、GSH含量的降低

2.11 检测血浆TNF-α和H2O2水平

实验使用ELISA检测小鼠血浆TNF-α含量,检测结果如图9(a)所示,Alcohol组相对于CON组小鼠血浆TNF-α含量显著增加(P<0.05);L2-BEA组和H2-BEA组小鼠血浆TNF-α含量相对于CON组显著增加(P<0.05),相对于Alcohol组显著降低(P<0.05)。荧光分光光度计法检测血浆H2O2含量,结果如图9(b)所示,Alcohol组相对于CON组小鼠血浆H2O2含量显著增加(P<0.05);L2-BEA组和H2-BEA组小鼠血浆H2O2含量相对于CON组显著增加(P<0.05),相对于Alcohol组显著降低(P<0.05)。由此可知,乙醇诱导小鼠血浆TNF-α含量和H2O2含量增加,而2-BEA可以减轻以上作用。

(a)血浆TNF-α水平 (b)血浆H2O2水平

2.12 Western 印迹检测蛋白质表达

实验使用Western Blot技术检测肝组织NF-κB p65蛋白质表达,结果如图10所示,Alcohol组相对于CON组小鼠肝脏细胞核内NF-κB p65蛋白质表达增加(P<0.05);L2-BEA组和H2-BEA组小鼠肝脏细胞核内NF-κB p65蛋白质表达高于CON组(P<0.05)、低于Alcohol组(P<0.05)。由此可知,乙醇诱导小鼠肝脏细胞核内NF-κB p65蛋白质表达增加,而2-BEA可以减轻此作用。

(a)Western Blot (b)WB结果的定量分析

3 讨论

随着我国酒精消费量的增长,ALD已成为致残致死率仅次于病毒性肝病的第二大肝脏疾病[12]。患者除了肝功能的障碍,还有血糖、血脂代谢的紊乱。乙醇导致肝损伤的机制错综复杂,相关损伤因素包括乙醇代谢产物乙醛毒性、炎症反应损伤、氧化应激损伤、细胞线粒体功能障碍、内毒素(Lipopolysaccharide,LPS) 损伤及营养不良等,其中氧化应激反应和炎症反应性损伤在 ALD 的发生发展过程中起到了至关重要的作用[13]。

乙醇代谢产物乙醛对于肝脏的毒性要远大于乙醇,是导致肝损伤的最主要原因。肝脏中过量乙醛及乙醇氧化代谢产物激活肝细胞微粒体酶细胞色素P450系统,使细胞色素P-4502E1酶(CYP2E1)活性升高,诱导肝脏细胞产生大量活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)[14]。过量的ROS在有氧条件下引发链式脂质过氧化反应,对肝脏细胞的生物膜、蛋白质和核酸等大分子物质具有严重的损害作用[15]。脂质过氧化反应会消耗体内的SOD和GSH,而这两者是清除体内自由基和保持抗氧化能力的主要物质;脂质过氧化产物MDA能够造成细胞脂膜溶解,破坏细胞结构和功能[16]。而SSAO在清除内源性和外源性胺的同时,产生的毒性醛类、H2O2和氨也可以促进氧化应激反应的发生。本研究中,乙醇诱导HepG2细胞SSAO活性升高,促进细胞产生和释放H2O2;而敲低了HepG2细胞的AOC3基因后,乙醇对细胞的上述作用均显著降低,并且随着SSAO活性的降低,毒性产物H2O2的生成减少;但是在乙醇的作用下,AOC3基因敲低和非敲低HepG2细胞TNF-α水平和核内NF-κB p65蛋白质表达无显著差别,说明乙醇诱导细胞SSAO活性升高并产生和释放H2O2,与NF-κB信号途径介导的炎症反应无关,主要是导致脂质过氧化反应和氧化应激损伤的发生。动物实验中所使用的2-BEA是一种强效和高选择性SSAO抑制剂[17],该物质通过抑制急性ALD小鼠血浆SSAO活性的增加,能显著改善乙醇诱导的肝组织急性病理学损伤,抑制血液中转氨酶的升高,降低血浆H2O2的释放,减少MDA的产生和SOD、GSH的消耗,说明抑制SSAO活性可以抑制脂质过氧化反应,减少细胞毒性物质的产生,从而减轻氧自由基对细胞的损伤,起到细胞质膜保护性作用。

本研究发现,体外实验中,乙醇作用下HepG2细胞功能的变化与NF-κB信号途径介导的炎症反应无关;而乙醇诱导小鼠血浆TNF-α含量增加,并且肝脏细胞核内NF-κB p65蛋白质表达增加,与NF-κB信号途径介导的炎症反应密切相关;说明乙醇在体内的作用更加复杂,不仅与脂质过氧化反应和氧化应激反应相关,还与肠源性内毒素入血密切相关。乙醇可以增加肠黏膜的通透性,破坏肠道的天然屏障作用,从而致使肠源性LPS入血增多。研究发现,血液中的LPS 可以激活肝脏中的固有免疫细胞-Kupffer细胞,激活NF-κB信号途径,产生大量 TNF-α等细胞因子和细胞趋化因子,参与炎症反应,从而促进氧化应激的发生,导致肝损伤的发生[18]。TNF-α是最主要的炎症效应因子,但是TNF-α抑制剂的使用常伴有严重的感染并发症和较高的死亡率,不推荐用于治疗酒精性肝炎[19]。本研究使用2-BEA治疗小鼠急性ALD,结果显示2-BEA不仅可以抑制脂质过氧化作用、减轻氧化应激损伤,还可以显著降低血浆TNF-α的释放,下调肝组织细胞核内NF-κB p65蛋白质的表达,从而抑制炎症性损伤。这是由于SSAO有膜结合型和可溶型两种存在形式,膜结合型SSAO又称为血管黏附蛋白-1(vascular adhesion protein-1, VAP-1)。有研究证明,SSAO抑制剂可减少淋巴细胞的黏附与迁移[20];VAP-1可能作为信号分子,与相应的配体siglec-10结合,启动下游反应,即VAP-1依赖的信号途径可能在炎症反应时中性粒细胞黏附中发挥启动的作用[21]。2-BEA抑制炎症性损伤的作用可能与2-BEA抑制VAP-1在淋巴细胞和中性粒细胞的黏附、迁移,从而抑制NF-κB信号途径激活、减轻炎症反应的发生有关。

研究发现,H2O2可激活磷脂酰肌醇激酶-3和蛋白激B,此途径在胰岛素介导的脂肪细胞葡萄糖转运时,对于葡萄糖转运蛋白-4(GLUT4)聚集到质膜起关键性作用[22]。而SSAO抑制剂或过氧化氢酶可消除这种作用,表明SSAO催化产物H2O2在SSAO介导的葡萄糖转运中起关键作用[23]。本研究证实,急性ALD小鼠乙醇灌胃6h后出现血糖显著增高,而12h后发生严重的低血糖,而2-BEA的使用能显著减轻上述症状,说明SSAO活性的抑制对过量酒精摄入导致的糖代谢紊乱有显著的治疗效果。

综上所述,2-BEA通过抑制急性ALD小鼠SSAO活性,进而减轻脂质过氧化反应,并且抑制肠道LPS入血后NF-κB信号途径的激活,从而显著减轻过量乙醇摄入造成的肝脏结构和功能损伤,以及血糖代谢的紊乱。但是2-BEA对人体的作用尚未得到深入研究,临床上寻找毒副作用较小的SSAO活性抑制剂或可成为预防治疗急性酒精性肝损伤的新靶点。