太空香蕉‘天成1 号’枯萎病菌的分离鉴定

卢丽俐，林文珍，王金英，郭 莺，蔡长福，蔡邦平*

(1. 厦门市园林植物园，福建 厦门 361003；2. 福建省亚热带植物研究所 / 福建省亚热带植物生理生化重点实验室，福建 厦门 361006)

香蕉Musa×paradisiaca是世界上最重要的水果之一，也是发展中国家最重要的四大作物之一[1]。我国是香蕉生产大国，也是重要的消费大国[2]。然而，世界各地香蕉产业正受到各类病害的威胁，其中由古巴尖孢镰刀菌Fusariumoxysporumf. sp.cubense(Foc)引起的香蕉枯萎病是一种毁灭性的土传病害[3—5]，给香蕉生产造成重大损失。

目前，已鉴定的尖孢镰刀菌萎蔫专化型生理小种有8个，其中4个可以引起香蕉枯萎病[6—8]。这4个生理小种危害的香蕉品种各不相同，Foc1号生理小种主要侵染大蜜哈(Gros Michel，AAA)，全世界都有发生；Foc2号生理小种仅局限在中美洲，只侵染三倍体杂种棱香蕉(Bluggoe, ABB)和其他相近的煮食香蕉；Foc3号生理小种只侵染羯尾蕉属Heliconia的野生种；Foc4号生理小种不仅侵染矮秆香芽蕉(Dwarf Cavendish，AAA)，还侵染所有对Foc1号和Foc2号生理小种感病的品种，是目前致病力最强的病菌[5,9]。在我国普遍存在的香蕉枯萎病致病菌多为Foc1和Foc4[10—11]。因此，香蕉枯萎病的防控及抗病育种已成为香蕉生产的研究热点[12—13]，对香蕉产业的持续健康发展具有重要意义。

本研究的香蕉品种为自主选育的太空诱变新品种‘天成1号’M.×paradisiaca‘Tiancheng No. 1’(MusaAAA Cavendish subgroup)。该品种是利用‘巴西蕉’M.×paradisiaca‘Baxijiao’为材料，于2002年搭载“神舟4号飞船”，经外太空辐射诱变而获得的，具有高产、早熟、抗逆性强、耐贮存等优点，目前在福建东南沿海的漳州、厦门、莆田等地区进行区域种植试验。在区域试验过程中，在漳州部分地区发现有‘天成1号’枯萎植株，其症状与镰刀菌枯萎病相似。本实验利用分子检测技术对分离的病原菌进行鉴定，以期明确该品种枯萎病病原菌，为‘天成1号’推广种植的枯萎病防控提供重要的基础资料，也为香蕉枯萎病的抗病种质资源筛选提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

于2022年7～8月从漳州天宝香蕉种植基地采集香蕉‘天成1号’典型发病植株，用于病菌分离(图1)。由福建省林业科技中心提供的香蕉‘天成1号’组培无菌苗用于病菌致病性测定。组培苗用无菌盆土培养，待长出4～5片叶、株高12～16 cm时接种病菌。

图1 太空香蕉‘天成1 号’枯萎病病株Fig. 1 Fusarium wilt of banana ‘Tiancheng No. 1’

1.2 方法

1.2.1 病菌分离纯化

用常规的组织分离法分离香蕉‘天成1号’枯萎病病原菌[14]。将发病植株假茎基部作为分离材料，在病健交界处切取0.5 cm × 0.5 cm小块组织，先用0.1%升汞消毒3～5 min，再用75%乙醇消毒35～50 s，之后用无菌水冲洗3次，把病菌组织放入PDA培养基中暗培养3～4 d。挑取病菌组织上产生的霉状物进行纯化培养。观察菌株生长性状，在显微镜下观察菌株形态特征。

1.2.2 致病性测定

采用灌根接种法将分离纯化的病原菌回接蕉苗[15—16]。菌株在PDA液体培养基中，28 ℃，170 r·min–1，震荡培养5 d，无菌纱布过滤培养液。将制备好的病原菌孢子悬液浇施在有伤根的香蕉‘天成1号’幼苗种植土壤中，每盆1株，3次重复。每盆浇施量50 mL，无菌水作空白对照。香蕉苗置于26 ℃人工气候培养箱中光照培养。从接种后第5天开始观察发病情况，并从病株上重新分离病原菌。

1.2.3 病原菌菌株鉴定

将纯化的菌株接种至PDA培养基，28 ℃恒温、避光培养4～5 d，观察菌落形态特征，对病原菌株进行形态学鉴定[17—18]。

采用全式金的EasyPure® Genomic DNA Kit方法提取菌株的菌丝体DNA，扩增ITS序列，扩增产物由生工生物工程(上海)股份有限公司测序[19—20]。测序结果通过NCBI进行BLAST比对分析，并从NCBI上下载同源性较高的碱基序列，用软件MEGA11构建系统发育树，以确定病原菌株的分类地位。

2 结果与分析

2.1 病原菌株的形态特征

从香蕉‘天成1 号’枯萎病病株上分离得到一株病原菌LWZ-XJ-4，在PDA 上纯化培养，菌落圆形，培养4 d，菌落直径5.5 cm。气生菌丝绒状、白色、纤细浓密，培养基底面呈红色或紫红色(图2A)，能产生分生孢子。镜检发现，分生孢子较多(图2B)，含质体，略透明，大型分生孢子数量最多，镰刀形，两头稍尖，稍弯，有3 至多个隔膜，一般为3 个隔膜，长30.1～54.1 μm × 3.6～4.0 μm，小型分生孢子多为椭圆形、无隔，长9.5～16.6 μm × 2.5～4.0 μm。厚垣孢子为透明状球形(图2C)，单生，直径1.7～9.5 μm。根据菌落形态和显微镜镜检结果，初步确定该病原菌为尖孢镰刀菌Fusariumoxysporum。

图2 病原菌菌落形态及显微特征Fig. 2 Colony morphology and microscopic characteristics of pathogenic bacteria

2.2 接种蕉苗发病症状

人工灌根接种病菌5 d后，蕉苗开始出现黄叶症状。随着时间的推移，蕉苗发病症状更严重，25 d后蕉苗基本枯萎死亡。发病初期，香蕉叶片边缘变黄，逐渐扩展至主脉。病叶由下至上、由外至里出现黄色斑块、萎蔫，最后整株枯萎死亡(图3)。剖开蕉苗球茎发现，球茎组织已全部变黑、腐烂，假茎组织可见红色斑点和线条状病变(图3)，根黑褐色，基部腐烂，植株易倒伏。接种病原菌蕉苗植株生长不良、矮小、萎蔫，心叶抽不出，生长停滞枯萎。对照植株未出现任何病症，长势健壮良好。

图3 灌根接种蕉苗25 d 后发病情况Fig. 3 Symptoms of banana ‘Tiancheng No. 1’ after 25 d artificial inoculation

2.3 病原菌株的分子鉴定

对病原菌菌株LWZ-XJ-4的ITS序列进行扩增，测得碱基序列(图4)，序列长573 bp。对病原菌株的测序结果在NCBI中进行BLAST比对，结果表明，菌株LWZ-XJ-4与尖孢镰刀菌属序列同源性≥90%，利用软件MEGA11构建以尖孢镰刀菌rDNA-ITS序列为基础的系统进化树(图5)，发现菌株LWZ-XJ-4与尖孢镰刀菌香蕉转化型菌株Fusariumoxysporum，LT571434.1的进化距离最近。

图4 菌株LWZ-XJ-4 的rDNA-ITS 序列Fig. 4 rDNA-ITS sequence of strain LWZ-XJ-4

图5 基于rDNA-ITS 序列构建的菌株LWZ-XJ-4 系统发育树Fig. 5 Phylogenetic tree constructed by strain LWZ-XJ-4 based on rDNA-ITS sequence

对发病植株再次组织分离获得的病原菌，其病原形态特征与接种病原菌形态完全一致。根据菌落形态、致病性测定结果和结合田间症状，最终确定引起太空香蕉‘天成1号’枯萎病病原菌为尖孢镰刀菌Fusariumoxysporum；经分子检测，该病原菌与尖孢镰刀菌古巴专化型4 号生理小种Fusariumoxysporumf. sp.cubenseRace 4 进化距离最近。

3 讨论

香蕉枯萎病是一种传染性较强的国际检疫性病害，对全球香蕉产业造成了巨大的损失[21]。在我国香蕉主产区枯萎病的发病情况也十分严重，不仅直接影响香蕉产量，而且迫使蕉农频繁地换地种植，从而造成生产资料和土地资源浪费，导致种植成本居高不下[22]。目前在病区除了种植抗病品种，尚无十分有效的防治措施[23]，因此选育和种植抗病品种是防控香蕉枯萎病的主要途径[24]。近年来，我国通过杂交育种[25]、突变育种[2]、生物技术育种等手段开展香蕉抗病品种的研究工作，并取得一些成果, 先后培育出多个抗(耐)病品种，如广东省农科院选育的‘粤科1号’‘粉杂1号’‘中蕉9号’等[12—13,25—26]。在国外，Bhagwat等[28]利用咖吗射线培养香蕉外植体后发现，部分组培苗表现出一定的抗病性。印度研究人员通过香蕉悬浮细胞辐射诱变获得抗香蕉枯萎病1号生理小种的抗病系“Maca”[29]。太空香蕉‘天成1号’是经过外太空辐射选育的新品种，具有优质高产的特点，但对枯萎病的抗性情况一直未有研究。本研究首次就该品种枯萎病感病情况及致病菌开展研究，通过病原菌的分离、纯化及鉴定，明确了引起香蕉‘天成1号’枯萎病的病菌为尖孢镰刀菌，且其与古巴专化型4号生理小种亲缘性最近。明确该病害及其致病菌，可为今后香蕉枯萎病研究和综合防治提供依据。

尖孢镰刀菌的遗传变异存在复杂性和多样性，不同生理小种的致病性差异明显，同一生理小种的不同菌株之间也存在致病性差异[30]。目前尖孢镰刀菌有4 个生理小种，其中Foc4 号生理小种是我国香蕉枯萎病的主要致病菌，在热带和亚热带地区均可以致病，且致病力最强，几乎可以侵染所有香蕉栽培品种[21]，曾经使得我国台湾地区的香蕉种植面积在20 世纪70 年代减少了90%[31]。本文结合rDNAITS 分子检测手段对分离的病原物进行鉴定，发现引起太空香蕉‘天成1 号’枯萎病病原菌与Foc4 号生理小种进化距离最近。目前太空香蕉‘天成1 号’处于试种栽培阶段，其抗病性及果实品质有待进一步验证。