基于网络药理学和实验验证探讨加味孔圣枕中丹治疗痴呆的分子机制

宋爱珍 周 杨 尚春光 吴智春,2 于华芸,2

(1 山东中医药大学中医学院,济南,250355; 2 山东省中医经典名方协同创新中心,济南,250355)

痴呆是一种以认知损害为特征的临床综合征,其损害程度足以影响患者的日常生活和社会交往,我国痴呆患病率为7.2%,高于6.2%的全球平均水平[1],且随着我国人口老龄化的不断加深,其患病率逐年增高,给家庭和社会带来沉重负担。

中医药在痴呆的预防和治疗中具有明显优势[2-3]。肾虚髓亏、痰瘀阻窍是痴呆常见的病因病机,临证治疗从益精填髓、化痰祛瘀着手,多有佳效[4-6]。加味孔圣枕中丹(Modified KongSheng Zhenzhong Pill,JWKSP)是《备急千金要方》孔圣枕中丹加减化裁的方剂,临证治疗肾虚痰瘀阻窍型痴呆具有一定疗效[7]。实验研究亦发现本方能够改善多种痴呆动物模型的学习记忆力[8-9],但其具体分子机制有待进一步明确。网络药理学基于“中药-成分-靶点-通路-疾病”互作网络,能系统、整体地分析中药以及有效成分与疾病、靶点、通路之间的关系,与中药复方多成分、多靶点、多通路协同作用特点相符合,可为中药复方药效物质基础和分子作用机制研究提供一定参考[10-11]。本研究基于网络药理学策略,结合分子对接技术,从多成分、多靶点、多通路角度分析JWKSP治疗痴呆的可能药效物质基础和潜在作用靶点,探讨其作用机制,为本方临床与实验研究提供思路和依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 取无特定病原体(Specific Pathogen Free,SPF)级雄性SD大鼠24只,6周龄,体质量240～260 g,由北京维通利华实验动物技术有限公司提供[动物许可证号:SCXY(京)2016-0011]。大鼠饲养于IVC独立送回风净化笼,恒温24 ℃,恒湿42%,光照明暗交替12 h/12 h,实验前适应性饲养7 d,自由摄食、摄水。实验动物及操作均符合山东中医药大学医学实验动物中心伦理委员会原则(伦理审批号:2019-0034)。

1.1.2 药物 JWKSP由山东中医药大学附属医院药剂科煎制,每毫升含龟甲0.33 g、生龙骨0.33 g、山茱萸0.28 g、肉苁蓉0.22 g、石菖蒲0.17 g、远志0.17 g、丹参0.28 g、川芎0.22 g。

1.1.3 试剂与仪器 脑源性神经营养因子(Brain-derived Neurotrophic Factor,BDNF)小鼠单克隆抗体(Abcam公司,美国,货号:ab205067),浓缩型DAB试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司,货号:ZLI-9017),超薄切片机(徕卡微系统有限公司,德国,型号:UC-7),石蜡切片机(徕卡微系统有限公司,德国,型号:MDF-382E),光学显微镜(Olympus公司,日本,型号:CX41)。

1.2 方法

1.2.1 JWKSP组成中药潜在活性成分筛选 利用中药系统药理学数据库与分析平台(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform,TCMSP),口服生物利用度(Oral Bioavailability,OB)≥30%,类药性(Drug-likeness,DL)≥0.18%;中医药百科全书数据库(Encyclopedia of Traditional Chinese Medicine,ETCM),DL Weight≥0.49。同时结合文献研究筛选JWKSP组成中龟甲、龙骨、石菖蒲、丹参、山茱萸、川芎、肉苁蓉、远志的潜在活性成分[12]。

1.2.2 JWKSP治疗痴呆的潜在作用靶点筛选 利用TCMSP、ETCM数据库筛选JWKSP各组成中药活性成分作用靶点。以“dementia”“cognitive imparirment”为关键词,应用disGeNET数据库、治疗靶点数据库(Therapeutic Target Database,TTD)、DrugBank数据库筛选痴呆相关疾病靶点。将JWKSP组成中药活性成分作用靶点和痴呆相关疾病靶点信息分别输入UniProt数据库,限定物种为“人类”,对靶点基因名进行标准化处理,韦恩法取其二者交集获得JWKSP治疗痴呆的潜在作用靶点。

1.2.3 靶点之间的蛋白质-蛋白质相互作用(Protein-protein Interaction,PPI)网络构建 将JWKSP治疗痴呆潜在作用靶点导入STRING数据库,限定物种为“人类”,获取靶点PPI网络信息,将节点和结合率分值等信息导入Cytoscape 3.6.0软件,构建靶点之间的PPI网络。其中节点代表各作用靶点,每条边代表靶点之间的相互作用关系。

1.2.4 JWKSP“中药-活性成分-潜在作用靶点”网络构建 将JWKSP的组成中药、潜在活性成分以及治疗痴呆潜在作用靶点导入Cytoscape 3.6.0软件，构建“JWKSP-中药-活性成分-潜在作用靶点”网络模型，应用Network Analyzer插件分析其拓扑参数。

1.2.5 JWKSP治疗痴呆潜在作用靶点的GO和KEGG分析 将JWKSP治疗痴呆潜在作用靶点导入Metascape数据库,设定物种为“人类”,从生物过程(Biological Process,BP)、分子功能(Molecular Function,MF)和细胞组分(Cellular Component,CC)3个方面进行基因本体(Gene Ontology,GO)富集分析;同时对潜在作用靶点的京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)信号通路注释分析。

1.2.6 分子对接实验 利用分子对接技术进一步验证JWKSP治疗痴呆的可能性。选取对应靶点数目最多的5个潜在活性成分作为对接的候选成分,选取1.2.3 PPI网络中Degree值较高的5个靶点作为候选靶点。利用PubChem数据库下载成分化合物的2D结构,RSCB PDB数据库下载候选靶点的3D结构,PyMOL软件对靶点蛋白进行去水加氢处理,AutoDock 4.2.6预测成分-靶点的结合,获得对接的结合能和氢键数,以评价成分与靶点蛋白的结合力和稳定性。结合能<-5.0 kcal/mol(1 cal=4.184 J)为结合良好标准。

1.2.7 分组与模型制备 24只SD大鼠随机分为假手术组、模型组和JWKSP组,每组8只。实验采用双侧颈总动脉结扎(2-VO)建立血管性痴呆(Vascular Dementia,VD)大鼠模型[13]。大鼠按4%水合氯醛以0.6 mL/100 g进行腹腔注射麻醉,沿颈部中线切开,分离双侧颈总动脉,无菌丝线双结扎,剪断颈总动脉。假手术组仅分离双侧颈总动脉。逐层缝合伤口,外敷少许青霉素钠。

1.2.8 干预方法 模型制备24 h后给药干预,JWKSP组灌胃给予JWKSP水煎浓缩液1.8 mL/100 g,模型组和假手术组给予等体积生理盐水灌胃,1次/d,连续给药30 d。

1.2.9 检测指标与方法

1.2.9.1 Morris水迷宫实验 Morris水迷宫装置参照文献[14]选用大鼠通用型圆桶,按方位将水面和水桶分成4个象限。实验时,将高度为35 cm,直径为8 cm的平台设置于东北象限,将大鼠先由远离平台的西南象限入水,然后分别由其他3个象限入水,至其找到平台,并在台上停留2 min。如果2 min未能找到,则将大鼠放在平台上2 min。实验历时4 d,每天固定时间段训练4次。第5天,撤去平台,将大鼠由任一入水点放入水中,记录其在90 s内的游泳轨迹,分析各组大鼠穿越平台象限的次数和平台象限内的游泳时间。

1.2.9.2 免疫组织化学法检测大脑皮质BDNF表达 4%多聚甲醛灌注取脑,石蜡包埋制片,常规脱蜡及抗原修复,按试剂盒说明书逐步进行免疫组织化学染色,用SABC法。BDNF蛋白主要在胞浆和细胞膜表达,阳性细胞可见棕黄色或棕褐色颗粒,采用Image Pro Plus医学图像分析系统进行图像分析,400倍镜下,随机取3个视野,测出BDNF阳性反应细胞的积分光密度。

2 结果

2.1 JWKSP组成中药化学成分 筛选获得JWKSP组成8味中药的潜在活性成分104个,其中丹参59个、石菖蒲5个、山茱萸13个、川芎7个、肉苁蓉5个、远志2个、龟甲3个、龙骨2个,共有成分8个(川芎和远志2个,丹参和山茱萸2个,山茱萸和川芎1个,山茱萸和肉苁蓉1个,山茱萸和石菖蒲1个,丹参、山茱萸和川芎1个)。

2.2 JWKSP治疗痴呆潜在作用靶点筛选及PPI网络分析 利用TCMSP、ETCM数据库预测筛选获得JWKSP组成中药成分作用靶点351个。利用disGeNET,TTD、DrugBank数据库筛选获得痴呆相关疾病靶点498个。韦恩法进行靶点交集获得JWKSP治疗痴呆的潜在作用靶点80个。见图1。STRING数据库构建JWKSP治疗痴呆的潜在作用靶点PPI网络,Cytoscape 3.6.0软件进行可视化分析。PPI网络图含有80个节点,786条边,平均节点度值为19.65,靶点之间联系密切,关系错综复杂。见图2。JWKSP治疗痴呆部分潜在作用靶点(按节点度值大小排列前25位)信息见表1。

图1 JWKSP治疗痴呆靶点韦恩图

图2 JWKSP治疗痴呆的潜在作用靶点PPI网络

表1 JWKSP治疗痴呆的部分潜在作用靶点信息

2.3 JWKSP-中药-活性成分-靶点网络模型拓扑分析 根据“JWKSP-中药-活性成分-潜在作用靶点”网络,删除没有对应疾病靶点的16个潜在活性成分,最终获得88个有疾病靶点的活性成分。网络共涉及176个节点(1个方剂节点、7个中药节点、88个活性成分节点、80个靶点节点)和752条边。Network Analyzer插件分析网络模型的拓扑参数,其中,网络平均连接度(Average Number of Neighbors)为7.966,网络中心度(Network Centralization)为0.37,网络异质性(Network Heterogeneity)为1.227,网络密度(Network Density)为0.046,其主要活性成分槲皮素(Quercetin)、β-谷甾醇(Beta-sitosterol)、熊果酸(Ursolic Acid)、山柰酚(Kaempferol)、丹参酮ⅡA(Tanshinone iia)、隐丹参酮(Cryptotanshinone)、丹参新酮(Miltirone)、丹酚酸(Salvianolic Acid)、月桂酸(Lauric Acid)等,分别或共同作用于AKT1、BDNF、CXCL10、CXCL8、EGF、NOS3、SLC6A4、PTGS2、ACHE、DRD2等靶点发挥作用。见图3。涉及的88个活性成分主要为醌类(27个,如丹参酮ⅡA、丹参隐酮等)、萜类(19个,如熊果酸、鼠尾草酚酮等)、黄酮类(8个,如木犀草素、山柰酚等)、脂肪酸类(8个,如硬脂酸、肉豆蔻酸等)及其他氨基酸类、甾体类、生物碱等化合物26个。部分成分见表2。

2.4 JWKSP治疗痴呆潜在作用靶点的GO富集分析 GO富集分析共获得GO条目191条(P<0.05),按P值高低排列GO条目,涉及血液循环(Blood Circulation)、血管直径调控(Regulation of Blood Vessel Diameter)、化学突触传递调控(Modulation of Chemical Synaptic Transmission)等BP 177条;涉及铵离子结合(Ammonium Ion Binding)、儿茶酚胺结合(Catecholamine Binding)、肾上腺素结合(Epinephrine Binding)等MF 9条;涉及膜筏(Membrane Raft)、脂膜筏(Plasma Membrane Raft)等CC 5条,分别占GO总条目的92.7%、4.7%和2.6%。见图4(前10位)。

图4 JWKSP治疗痴呆的潜在靶点GO富集分析

2.5 JWKSP治疗痴呆潜在作用靶点的KEGG通路归类分析 KEGG通路归类分析,共获得229条信号通路,按P值高低排序结果,涉及神经活性配体-受体相互作用、AMPK信号通路、VEGF信号通路等20个通路分类。见表3。

表3 JWKSP治疗痴呆的KEGG富集通路分析

2.6 JWKSP主要成分与关键靶点分子对接结果 选取Degree值较高的5个成分,分别为槲皮素、熊果酸、β-谷甾醇、山柰酚、丹参酮ⅡA分别与ALB、IL-6、TP53、AKT1、BDNF进行分子对接实验验证。结果显示,山柰酚与AKT1结合能为-9.3 kcal/mol,氢键数最高;熊果酸与IL-6、丹参酮ⅡA与BDNF结合能分别为-8.0 kcal/mol、-6.9 kcal/mol,具有相对较多的氢键数量,β-谷甾醇与TP53、槲皮素与ALB结合能分别为-5.8 kcal/mol、-7.7 kcal/mol,氢键数量较少。见表4,图5。

图5 JWKSP成分与靶点对接模式

表4 JWKSP有效成分与关键靶点对接情况

2.7 JWKSP对大鼠记忆力的影响 与假手术组比较,模型组大鼠平台穿越次数显著减少,平台象限内游泳时间显著缩短,差异有统计学意义(P<0.05);与模型组比较,JWKSP组穿越平台次数略有增加,但差异无统计学意义(P>0.05),平台象限内游泳时间显著延长,差异有统计学意义(P<0.05)。见图6。

图6 Morris水迷宫穿越平台次数及象限内游泳时间

2.8 JWKSP对大鼠皮层BDNF表达的影响 BDNF蛋白呈深染的棕褐色,与假手术组比较,模型组大鼠皮层BDNF表达升高,但差异无统计学意义(P>0.05);与模型组比较,JWKSP组BDNF表达显著升高,差异有统计学意义(P<0.05)。见图7。

3 讨论

据统计我国痴呆患者总数超过1 600万,占全球1/4[1],其患病率随着人口老龄化程度的增加而逐年上升,亟须采取有效手段进行防治。中医学对痴呆疾病认识较早,其描述主要散见于“善忘”“健忘”“好忘”“呆病”“文痴”等。古今医家临床在辨证施治的基础上创制了许多卓有成效的方剂,如《备急千金要方》载有好忘方16首,《辨证录·呆病门》载转呆丹6方[15]。

痴呆好发于中老年人,病位在脑,功能物质基础为髓,《医林改错》明确指出“年高肾虚,髓海空虚”“年高无记性者,脑髓渐空”。多由年迈之人,肾精亏虚,致精髓不充,髓海渐空;此外,肾精亏虚,精不化血,阴血无以运化而成瘀;肾精不足,肾气亏损,津液失于蒸化则为痰,痰瘀互结,上蒙清窍,致脑失所养,渐成呆病。可见痴呆以肾虚髓海失充为病本,痰瘀阻窍为病标,治宜补肾益精生髓,活血化痰通窍。孔圣枕中丹,又名孔子大圣智枕中方,为《备急千金要方》所载好忘首方,谓其“常服令人大聪”。课题组前期针对痴呆病机特点,以本方加山茱萸、肉苁蓉、川芎、丹参化裁JWKSP,方中龟甲、山茱萸、肉苁蓉补肾生精益髓;川芎、丹参活血祛瘀;石菖蒲、远志化痰开窍醒神。临床和动物实验研究发现本方可以改善认知功能[7-9],但其活性成分、作用靶标及作用机制缺乏进一步研究。网络药理学目前在中药复方研究领域中应用较多,能较为全面系统预测中药方剂活性成分、潜在作用靶标等,为方剂现代化研究提供新的思路与方法[16-17]。本研究利用网络药理学和分子对接方法,基于方剂、中药、活性成分、疾病、作用靶点、有效通路之间关系的可视化分析,对JWKSP抗痴呆药效物质基础和分子机制进一步分析挖掘。

研究筛选获得的JWKSP 88个对应痴呆疾病靶点的活性成分中,槲皮素、熊果酸、β-谷甾醇、丹参酮ⅡA、隐丹参酮、山柰酚、丹酚酸、月桂酸等活性成分拓扑分析度值较高。现代药理学研究发现槲皮素、肉苁蓉所含黄酮类成分具有抗氧化、抑制β淀粉样蛋白纤维形成等作用,对血管性和老年性痴呆均有防治作用[18]。丹参酮ⅡA、隐丹参酮为来源于丹参的脂溶性成分,丹参酮ⅡA可抑制海马神经元凋亡,改善痴呆模型大鼠空间学习记忆障碍,具有较好的保护神经和改善学习记忆力;隐丹参酮可提高APP/PS1小鼠的空间学习和记忆力,对记忆损伤具有明显改善作用。丹酚酸是丹参水溶性成分,亦可改善痴呆大鼠认知功能缺陷[19-21]。石菖蒲含有的黄酮类成分山柰酚,被认为是针对老年痴呆认知缺陷的潜在神经保护剂[22]。山茱萸成分月桂酸在治疗情绪障碍和认知功能障碍方面具有潜在功效[23],与研究预测结果相符,提示以上活性成分可能是JWKSP抗痴呆作用的主要物质基础。

“JWKSP-中药-活性成分-靶点”网络模型分析显示88个活性成分分别或交互作用于AKT1、CXCL8、CXCL10、BDNF、NOS3等80个痴呆疾病靶点。BDNF具有促进神经元存活和突触完整性等作用,被认为是认知状况的有益标志物,其水平与认知障碍之间存在显著相关性[24-25]。趋化因子在中枢神经系统疾病的调节中起关键作用,预测疾病靶点中的趋化因子CXCL8、CXCL10与阿尔茨海默病和中风等多种神经退行性疾病有关,有研究显示CXCL8可能是艾滋病病毒相关神经认知障碍的潜在治疗靶标[26-27]。NOS3是内源性一氧化氮的主要合成酶,是重要的血管扩张因子和脑血流的调节信使分子,Meta分析显示NOS3基因多态性与阿尔茨海默病、VD发生均存在一定相关性[28-29]。此外,ESR1、雌激素受体β(ESR2)、PTGS2、SLC6A4等均有文献报道为痴呆易感基因,参与痴呆的发生、发展[30-32],是治疗痴呆药物的重要靶点,可能在JWKSP抗痴呆过程中发挥相对重要的作用。

“JWKSP-中药-活性成分-靶点”网络模型分析显示JWKSP组成中药的活性成分作用于痴呆疾病靶点的形式是复杂多样的,可以是来源于单味中药的单一或多种活性成分,如槲皮素(肉苁蓉)可作用于CXCL8、CXCL10、NOS3等30多个靶点;丹参酮、异丹参酮Ⅱ、丹参新醌等丹参活性成分共同作用于ESR1和ESR2靶点;或由不同中药来源的不同活性成分,如槲皮素(肉苁蓉)、丹参酮ⅡA(丹参)均可作用于TP53靶点;抑或是共有活性成分,如β-谷甾醇(山茱萸和肉苁蓉)、熊果酸(丹参和山茱萸)可共同作用于PTGS2、Bcl-2、Bax靶点,β-谷甾醇尚可作用SLC6A4、DRD1等靶点,熊果酸另可作用于NOS3、MMP3、IL-6等靶点发挥抗痴呆生物学效应。提示JWKSP各组成中药之间存在一定相辅或相制作用关系,以多成分单独、共同或交互作用于疾病靶点,从而发挥整体协同作用治疗痴呆,符合中医方剂多成分、多靶点综合防治疾病的特点。

对JWKSP治疗痴呆靶点进行生物学功能分析,GO分析中涉及膜筏、脂膜筏等CC 5条,膜筏富含胆固醇和鞘脂,与细胞衰老相关信号通路失调密切相关[33],膜筏中胆固醇水平与β淀粉样蛋白含量、老年性痴呆发生相关[34]。涉及MF 9条,肾上腺素结合相关的GO term显著富集,分别为儿茶酚胺结合、肾上腺素结合、肾上腺素能受体活性、α1肾上腺素能受体活性、α2肾上腺素能受体活性5条。已有研究发现α1和α2肾上腺素能受体在阿尔茨海默病性痴呆患者选定脑区域中有显著变化,而α2-肾上腺素受体激动剂可乐定能改善脑缺血再灌注引起的认知功能障碍[35-36],提示JWKSP可能通过影响单胺类神经递质及受体功能发挥痴呆治疗作用。涉及BP 177条,最为显著性前3位分别为血液循环、血管直径调节和血管大小调节,提示调节脑循环BP是JWKSP补肾活血,化痰开窍防治痴呆的重要机制之一。

痴呆发病机制与胆碱能途径、细胞凋亡、炎症反应、氧化应激、血液流变学异常等多病理机制有关,JWKSP治疗痴呆靶点KEGG通路分析富集神经活性配体-受体相互作用、AMPK信号通路、间隙连接、VEGF信号通路等通路分类参与上述病理机制。神经活性配体-受体相互作用通路分类包括Ca2+信号和cAMP信号2条具体通路,涉及毒蕈碱型胆碱受体M1(CHRM1)、NOS2、BDNF等靶点。CHRM1基因编码的毒蕈碱型胆碱受体M1受体高度参与认知[37],CHRM1可通过Gq/11激活PLC-IP3/Ca2+信号通路,参与突触可塑性、神经元凋亡、学习记忆等多种神经生物学功能。AMPK信号通路主要涉及AKT1、Bcl-2、Bax等靶点,AMPK被称为细胞能量调节器,当AMPK激活,可调节其下游PI3K/AKT,核因子κB等信号通路,干预凋亡蛋白Bcl-2、Bax等表达,抑制神经元凋亡,并改善氧化应激、神经炎症等[38-39]。VEGF信号通路主要涉及AKT1、NOS2、NOS3等靶点,VEGF/AKT/NOS3信号通路参与血管生成,在VEGF的作用下,活化的AKT和NOS3结合,NOS3被磷酸化丝氨酸激活,产生一氧化氮,引起血管舒张、血管重塑和血管生成[40],此外激活VEGF信号通路还可导致轴突分支增加[41]。提示JWKSP可能作用于AKT1、CHRM1、BDNF、Bcl-2、Bax、NOS3等靶点,通过神经活性配体-受体相互作用、AMPK、VEGF等信号通路发挥作用调节胆碱能系统、抑制神经元凋亡、改善神经炎症、促血管生成、影响神经可塑性等作用,这是本方治疗痴呆的相关分子机制。

综上所述,槲皮素、丹参酮ⅡA、隐丹参酮、熊果酸、山柰酚等JWKSP活性成分单独或交互作用于AKT1、BDNF、NOS3等靶点,通过神经活性配体-受体相互作用、AMPK、VEGF等信号通路发挥治疗痴呆作用,具有多成分、多靶点、多通路等特点。分子对接实验结果显示JWKSP中的活性成分与治疗痴呆疾病的关键潜在作用靶点结合能力较强且具有较好的稳定性,表明基于网络药理学方法进行JWKSP中有效成分治疗痴呆的预测具有一定科学性。

通过制备VD大鼠模型发现,JWKSP可明显延长VD大鼠平台象限游泳时间,提高模型大鼠皮层BDNF表达水平,提示本方可通过影响BDNF表达,发挥改善痴呆模型大鼠记忆能力作用,为本方进一步研究提供依据。

利益冲突声明:无。