Irisin对C2C12细胞胰岛素抵抗的影响

何 茜 王 梅 吴 炼

（贵州省人民医院内分泌科，贵州 贵阳 550002）

胰岛素抵抗是2型糖尿病病理生理机制中的关键环节，骨骼肌、肝脏和脂肪组织是胰岛素作用的3个重要靶器官，在胰岛素的作用下，这些组织对葡萄糖的摄取及代谢能力减弱，需要更多胰岛素方能维持机体葡萄糖稳态的状态称为胰岛素抵抗[1-2]。全身葡萄糖摄取的90%以上在骨骼肌完成[3]，因此，在胰岛素刺激下，骨骼肌对葡萄糖的摄取、转运以及代谢能力下降是造成机体葡萄糖代谢紊乱的重要原因[4]。

鸢尾素（irisin）是2012年新发现的肌因子，由112个氨基酸组成，可诱导脂肪细胞产热并激活脂肪细胞棕色化程序[5]，因而，其在肥胖及糖尿病等代谢性疾病的治疗方面被寄予厚望[6]。C2C12是小鼠成肌细胞系的亚株，是体外研究骨骼肌胰岛素抵抗发病机制的理想细胞模型[7]。本研究旨在探讨irisin对C2C12细胞胰岛素抵抗的影响，以期为irisin与糖代谢的关系提供更多理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料 小鼠成肌细胞C2C12，购自中国科学院细胞库。

1.2 试剂 DMEM完全高糖培养基及DMEM不完全高糖培养基（江苏凯基生物技术股份有限公司）；1×PBS（0.01 M，pH 7.4）（江苏凯基生物技术股份有限公司）；特级马血清（北京索莱宝科技有限公司）；胎牛血清（美国 Scien Cell公司）；胰岛素（美国Glpbio 公司）；重组 irisin（美国Peprotech公司）；2-NBDG（上海源叶生物科技有限公司）；棕榈酸（上海源叶生物科技有限公司）。

1.3 主要仪器 CO2培养箱（上海一恒科学仪器有限公司）；倒置显微镜（广州市明美光电有限公司）；NovoCyteTM流式细胞仪[艾森生物（杭州）有限公司]。

1.4 实验方法

1.4.1 C2C12细胞的生长与诱导分化 在37 ℃ 5%CO2条件下，用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素的高糖DMEM培养基培养小鼠成肌细胞C2C12，每1～2 d更换培养液，依细胞生长情况传代。实验用细胞弃去原培养上清，用1×PBS洗涤两遍，用0.25%胰酶（含0.02% EDTA）消化2～3 min，加入培养基终止消化，悬起细胞；将细胞收集至10 mL离心管中，以1 000转/分的转速离心3 min，弃尽上清，加入培养基，用吸管吹匀；将细胞悬液稀释至适当的细胞密度，然后加至准备好的培养板中，置于37 ℃ 5%CO2培养箱中培养。待细胞汇合时，换为含2%马血清的培养液诱导，每2 d更换一次诱导液，4 d后在倒置显微镜下观察细胞形态，直至细胞分化为多核肌管细胞。

1.4.2 C2C12细胞胰岛素抵抗模型的建立 将分化后的C2C12细胞分为对照组和胰岛素抵抗模型组，用DMEM高糖培养基培养对照组，用含250 μM棕榈酸的DMEM高糖培养液培养胰岛素抵抗模型组细胞；培养24 h后，两组细胞用100 nmol/L胰岛素孵育30 min，用50 μM荧光葡萄糖类似物2-NBDG处理细胞30 min，采用流式细胞仪检测细胞平均荧光强度。

1.4.3 Irisin不同浓度对胰岛素抵抗C2C12细胞葡萄糖摄取的影响 用不同浓度（0 nmol/L、2.5 nmol/L、5 nmol/L、10 nmol/L）重组irisin处理胰岛素抵抗C2C12细胞24 h，然后用100 nmol/L胰岛素孵育30 min，再用50 μM 2-NBDG处理30 min，采用流式细胞仪检测细胞平均荧光强度。

1.4.4 Irisin不同处理时长对胰岛素抵抗C2C12细胞葡萄糖摄取的影响 将胰岛素抵抗C2C12 细胞以5 nmol/L重组irisin分别处理0 h、1 h、4 h、24 h，然后用100 nmol/L胰岛素孵育30 min，再用50 μM 2-NBDG处理30 min，采用流式细胞仪检测细胞平均荧光强度。

1.5 统计学分析 统计分析采用SPSS 22.0软件进行。数据用（）表示。采用独立样本t检验进行两组间的比较，单因素方差分析（ANOVA）进行多组间的比较，LSD检验进行两两比较。以双侧P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 C2C12细胞胰岛素抵抗模型的建立 C2C12细胞经棕榈酸处理24 h，采用流式细胞仪检测细胞平均荧光强度，评估细胞对2-NBDG的摄取。与对照组比较，胰岛素抵抗模型组葡萄糖摄取显著降低（t=29.114，P＜0.001），提示胰岛素抵抗模型建立成功。见表1。

2.2 不同浓度重组irisin对胰岛素抵抗C2C12细胞葡萄糖摄取的影响 以不同浓度（0 nmol/L、2.5 nmol/L、5 nmol/L、10 nmol/L）重组irisin处理胰岛素抵抗C2C12细胞24 h，采用流式细胞仪检测细胞平均荧光强度。如图2所示，5 nmol/L及10 nmol/L重组irisin均可减轻棕榈酸对C2C12细胞葡萄糖摄取的抑制。

图1 棕榈酸对 C2C12 细胞葡萄糖摄取能力的影响（n=3，）

图2 不同浓度irisin对胰岛素抵抗C2C12细胞葡萄糖摄取的影响（n=3，）

2.3 重组Irisin不同处理时长对胰岛素抵抗C2C12细胞葡萄糖摄取的影响 以5 nmol/L重组irisin处理胰岛素抵抗C2C12细胞不同时长（分别为0 h、1 h、4 h及24 h），采用流式细胞仪检测细胞平均荧光强度。如图3所示，重组irisin以时间依赖的方式改善棕榈酸对C2C12细胞葡萄糖摄取的抑制，以24 h的作用最强。

图3 Irisin不同处理时长对胰岛素抵抗C2C12细胞葡萄糖摄取的影响（n=3，）

3 讨论

胰岛素抵抗是2型糖尿病重要的病理生理机制之一，胰岛素在靶组织中的作用减弱是胰岛素抵抗的本质和始动因素[8]。作为胰岛素作用的重要靶器官之一，骨骼肌对葡萄糖的摄取、转运以及代谢能力下降被认为是2型糖尿病发生的重要胰腺外因素[9]。骨骼肌质量约占健康成人体质量的40%～50%。研究发现，运动可使肌纤维收缩，从而产生和释放数百种细胞因子或多肽，称为肌因子，可发挥自分泌、旁分泌或内分泌效应。因此，骨骼肌也逐渐被视为重要的内分泌器官[10-12]。

Irisin的前体Ⅲ型纤连蛋白结构域包含蛋白5（Fibronectin type Ⅲ domain-containing protein 5，FNDC5）高表达于骨骼肌。FNDC5属Ⅰ型膜蛋白，在蛋白水解酶的作用下，经C-末端剪切后成为含112个氨基酸的多肽片段，并经糖基化修饰后释放入血，这一多肽片段被命名为irisin[5,13]。早期研究发现，irisin可诱导白色脂肪细胞棕色化，增加产热以及能量消耗，可使高脂饮食诱导的肥胖小鼠体质量减轻、血糖及胰岛素水平下降，胰岛素抵抗获得改善[5]。后续研究发现，irisin还可作用于骨骼肌、肝脏、胰腺等多个器官及组织，通过多种病理生理机制发挥维持葡萄糖稳定的作用[14-15]。

棕榈酸是一种饱和游离脂肪酸，可对胰岛素信号通路产生抑制效应，从而诱发胰岛素抵抗[16]。棕榈酸诱导的骨骼肌细胞胰岛素抵抗模型是一种理想的体外胰岛素抵抗模型，被广泛用于探索骨骼肌胰岛素抵抗的潜在机制[17]。而C2C12是小鼠成肌细胞系的亚株，是体外研究骨骼肌胰岛素抵抗的理想细胞模型[7]。

本研究发现，棕榈酸可显著降低胰岛素刺激下骨骼肌细胞对荧光葡萄糖类似物2-NBDG的摄取，诱导胰岛素抵抗，与既往研究[18-19]一致。重组irisin以浓度依赖的方式减轻棕榈酸对C2C12细胞葡萄糖摄取的抑制，5 nmol/L及10 nmol/L重组irisin均可发挥这一效应，与Xin等[20]的研究结果相符。另一项研究也表明，irisin的过表达可增加棕榈酸诱导的胰岛素抵抗C2C12细胞的葡萄糖摄取，改善胰岛素抵抗[21]。Ye等[22]进行的研究采用高胰岛素建立C2C12细胞胰岛素抵抗模型，随后用不同浓度重组irisin处理细胞，结果发现，irisin可显著增加胰岛素刺激下C2C12细胞的葡萄糖摄取。本研究还发现，重组irisin减轻棕榈酸对C2C12细胞葡萄糖摄取的抑制、改善胰岛素抵抗的作用呈时间依赖性，尤以24 h的作用最为显著。

综上所述，本研究证实了irisin可减轻棕榈酸诱导的C2C12细胞胰岛素抵抗，为irisin与糖代谢的关系提供了一定理论基础，未来还需深入研究irisin减轻骨骼肌胰岛素抵抗、改善葡萄糖代谢的分子机制。