一例肉鸡传染性支气管炎、H9亚型禽流感与大肠杆菌混合感染的诊断与防治

马芹 刘丹丹 邹志强 马元元 魏书强 李玉峰 汪建华

中图分类号：S858.31 文献标识码：C 文章编号：1673-1085（2023）08-0088-05

鸡传染性支气管炎（Infections bronchitis， IB）是由传染性支气管炎病毒（Infections bronchitis virus， IBV）感染引起的一种急性、高度接触性传染病，最早发现于美国[1， 2]。H9亚型禽流感（Avian influenza， AI）是由H9亚型禽流感病毒（Avian influenza virus， AIV）引起的传染病，该病为低致病性禽流感，广泛分布于全国各地[3]。近几年，随着我国肉鸡规模化养殖不断发展，饲养条件得到了较大的改善，但是肾型传染性支气管炎的发病率没有减少反而有增高的趋势。该病典型的剖检症状为支气管栓塞、花斑肾，如果饲养管理不当易继发大肠杆菌，使临床鸡群出现死淘较高的现象[4]。目前鸡传染性支气管炎病毒、H9亚型禽流感病毒和大肠杆菌的混合感染对临床造成了巨大的经济损失，本文从临床诊断、病理剖检及实验室检测等方面展开，建立科学有效的诊断和治疗方法，对临床防控提供参考。

1 材料与方法

1.1 病料来源

山东聊城地区某养殖场18日龄商品肉鸡。

1.2 主要试剂

营养琼脂、胆硫乳、SS培养基购于青岛海博生物技术有限公司；核酸提取试剂盒购于杭州博日科技股份有限公司；PCR反应式试剂购于南京诺维赞生物科技有限公司；微生物药敏片购于杭州微生物试剂有限公司产品等。

1.3 方法

1.3.1 临床观察与剖检 肉鸡16日龄出现精神不振、有呼吸道症状，18日龄出现张嘴呼吸，全群死淘80～100只，23日龄死淘继续上升，单日死淘400多只。将病死鸡羽毛打湿，放置在解剖盘上，暴露其胸、腹腔，观察气囊、肺脏、肝脏、脾脏、肾脏、肌胃、腺胃等脏器有无明显的病理变化，沿病死鸡头部一侧剪开，观察喉头、气管、支气管有无病变。

1.3.2 细菌分离培养 在无菌工作台内，取肝脏划线接种于营养培养基、胆硫乳培养基、SS培养基上，37 ℃温箱放置18～24 h，观察培养基上菌落颜色和形态。

1.3.3 病毒检测 取病死鸡的气管、喉头、肺、肝脾、法氏囊等脏器剪碎后按1：3比例加入无菌PBS溶液，充分研磨制备组织悬液，反复冻融3次后，8 000 r/min 离心10 min，取上清液用于病毒核酸的提取，具体提取步骤参考试剂盒内说明书。将提取的核酸进行疑似病原如H9亚型禽流感、传染新支气管炎病毒（IBV）、传染性喉气管炎病毒（ILTV）、传染性法氏囊病毒（IBDV）、偏肺病毒（aMPV）、新城疫病毒（NDV）的PCR扩增，PCR扩增体系和程序参照南京诺唯赞扩增试剂说明书进行，扩增结束后在凝胶成像系统下进行观察，阳性产物胶回收后连接转化并进行测序分析。

1.3.4 病毒分离培养 将1.3.3制备的组织悬液经0.22 μm滤器过滤后，接种于9日龄SPF鸡胚，每枚接种0.2 mL。放置于37 ℃温箱培养，每天观察有无死胚，24 h之内的死胚弃去，若出现死胚，收取24～144 h内死亡鸡胚的尿囊液及胚体；若无死胚现象盲传5代，进行PCR鉴定。

1.3.5 药敏试验 参考K-B纸片法[5]进行分离菌株的12种药物（大观霉素、恩诺沙星、新霉素、卡那霉素、头孢噻肟、多西环素、氟苯尼考、阿莫西林、氨苄西林、林可霉素、多粘菌素B、复方新诺明）的敏感性分析。将菌液均匀涂布于营养琼脂培养板上，间隔适当位置进行药敏片的粘贴与固定，在37 ℃恒温培养箱倒置培养24 h，量取抑菌圈的直径，判定药物的敏感性。

2 结果

2.1 剖检结果

病死鸡通过剖检观察到肌胃、腺胃交接处有轻微出血，个别有纤维素性气囊炎、心包炎和肝周炎，肝脏破裂出血，脾脏出血肿大，肾脏肿大呈典型的花斑状，支气管内有黄色干酪样硬物，气管内有出血点；见图1。

2.2 细菌分离结果

经分离培养后，营养培养基上长出纯净单一的白色、边缘光滑的菌落；胆硫乳和SS培养基上长出红色或粉红色小菌落，周围有胆酸盐沉淀圈，镜检观察到革兰氏阴性短杆菌，符合大肠杆菌的培养与镜检结果。

2.3 病毒检测结果

通过PCR扩增，结果显示IBDV、ILTV、aMPV、NDV未扩增出目的条带，H9、IBV有单一条带，且大小与目的片段一致，见图2；经测序和Blast比对分析H9、IB阳性。将IBV进行S1基因测序，绘制进化树（图3），分析可知，该分离毒株属于GI分支，且与QX株关系最近，为同一分支，与GII-GVII等分支的同源关系较远。经Megalign比对分析可知，该分离毒株与QX株的同源性在90.4%～92%；与GII的同源性在59.3%，与GIII株同源性在61.4%，与GIV株同源性在57.2%，与GV同源性在64.7%，与GVI同源性在63.2%～63.6%，与GVII株同源性在67.3%，详见图4。

2.4 病毒分离培养结果

鸡胚分离结果显示，传代培养后F3仍有90%的雞胚存活，收获尿囊液盲传至F4，死亡率为50%，收获观察到胚体发育矮小并蜷缩成球状，羊膜增厚附着在胚体上，为典型的传染性支气管炎症状（图5）。

2.5 药敏试验结果

目前实验室药敏结果显示该大肠杆菌分离株对新霉素、多粘菌素B和多西环素敏感性较低，对大观霉素、恩诺沙星、卡那霉素、头孢噻肟、氟苯尼考、阿莫西林、氨苄西林、林可霉素、复方新诺明等9种药物不敏感。大肠杆菌分离株药敏试验结果见表1。

3 讨论与结论

肉鸡传染性支气管炎、H9亚型禽流感与大肠杆菌混合感染后，剖检观察肌胃腺胃交接处出血，支气管内有黄色干酪样硬物，肾脏肿大呈花斑样，这与现场初期出现呼吸道症状、采食量下降以及随后排水样白色稀粪、粪便中含有大量尿酸盐、死亡率升高相吻合[6]。传染性支气管炎病毒是冠状病毒科冠状病毒属，经鸡胚分离时能观察到胚体发育萎缩呈小丸形，羊膜增厚，紧贴胚体，卵黄囊缩小，尿囊液增多，再经PCR和测序分析确定病原，本试验为临床传染性支气管炎感染病例提供了诊断技术和方法。临床上发病后检测是一方面，另一方面还应查清病因并进行预防。本试验通过临床分析、病理剖检、细菌分离培养、病毒分离及分子生物学诊断等方法，确定了病原为传染性支气管炎病毒、H9亚型禽流感病毒与大肠杆菌。大肠杆菌多随病鸡粪便排出体外，从而污染饲料、饮水、环境等，因此动物养殖环境的卫生条件和粪污的无害化处理等因素直接影响着的大肠杆菌的发生和流行[7-9]。本次发病临床上紧急使用VC通肾，并使用传染性支气管炎活苗饮水，5日后使用强力霉素1个疗程，使疾病得到了有效控制。为了防止该病再次发生，生产上应强化饲养管理，给鸡群提供优质全价饲料，严格执行环境卫生消毒防疫措施，消灭传染源，切断传播途径。

参考文献：

[1]  韩雪芹，李斌.重新认识传支做好对型防控[J].今日畜牧兽医，2020，36（1）：23.

[2]  宁岱.鸡传染性支气管炎病毒的生物学特征及分型[J].当代畜牧，2018，29（10）：56-57.

[3]  程祥琴.非典型新城疫与H9亚型禽流感混合感染的防治[J].中国家禽，2009，31（8）：51.

[4]  徐翠娟.规模化肉鸡饲养要重视肾型传支的防治[J].山东畜牧兽医，2018，39（5）：29-30.

[5]  陶伟杰，段笑笑，赵辉，等. 血清7型副猪嗜血杆菌的分离鉴定及生物学特性研究[J].动物医学进展，2021，42（12）：14-19.

[6]  冀威.鸡传染性支气管炎的诊断与治疗[J].畜牧业环境，2020，8（1）：69.

[7]  殷泽禄，万虎. 大肠杆菌的研究综述[J].甘肃畜牧兽医，2019，49（5）：33-35.

[8]  李永清，甘孟侯.禽大肠杆菌病防制研究进展[J].中国兽医学报，2000，20（4）：414-416.

[9]  廖晓萍，岳磊，曾振灵.禽源大肠杆菌耐药现状与防治对策[J].中国家禽，2008，30（6）：1-5.