抗癌药物递送载体牛奶外泌体的研究进展

武大伟，宁 莉

天津医科大学第二医院检验科，天津 300211

1 前言

外泌体是天然的细胞外纳米囊泡，通过携带诸如蛋白质、微小RNA、mRNA、DNA和其他分子的生物活性物质参与细胞间通讯［1-2］，因其体积小（直径40～100 nm），外泌体是个性化治疗中很有前途的递送载体［3］。由于尚未开发出人工外泌体合成方法，因此，有效、安全地从自然资源中大量获取外泌体是当下迫切的任务。外泌体可从各种生物体液中分离得到，如血浆、尿液、唾液、乳汁、羊水、腹水、脑脊液等。其中，乳汁是唯一可以量产的含有外泌体的生物液体。人乳外泌体于2007年首次描述。迄今为止，已从人、牛、猪、小袋鼠、骆驼、大鼠、马、熊猫、绵羊和山羊奶中分离出外泌体［4］。牛奶外泌体被认为是开发新的治疗方法以治疗包括癌症在内的各种疾病的最有希望的候选者。牛奶外泌体在癌症治疗的应用中有两个方向，分别是抗肿瘤药物和治疗性核酸的递送。在使用细胞毒性剂和细胞抑制剂的过程中发生的各种副作用是尚未解决的癌症化疗问题。使用细胞抑制药物不仅会导致肿瘤细胞死亡，还会导致骨髓，皮肤，毛发，胃肠道上皮细胞等［5］死亡。有针对性的化疗药物输送是化学疗法中发生毒性作用的潜在解决方案［6］。外泌体可用作药物传递系统，将治疗性核酸的药物载于表面，或使用电穿孔、超声处理或配体“装载”这些成分后携带于表面［7］。另一种方法是将外泌体与脂质体融合，并掺入必要的内容物以形成“嵌合”外泌体［8］。因此，本文就牛奶外泌体分离方法、生物成分分析及在癌症治疗中的应用前景进行综述。

2 牛奶外泌体的分离

可以使用各种物理、物理化学和免疫学方法从牛奶中分离外泌体。在国际细胞外囊泡学会的指南中描述了有关外泌体分离和鉴定的一般性问题［9-10］。由于从单个人或动物身上获得的乳汁量可能会从毫升到升不等。因此，从乳汁样品中分离外泌体的一般方法通常就是离心。首先，在600～1 000×g 的低速下进行几次连续离心，脱脂并沉淀细胞；然后在10 000～16 000×g 离心沉淀乳蛋白，最后在100 000～200 000×g［11］进行一次或数次超速离心以分离外泌体。

超速离心或凝胶过滤分离人乳、牛乳和马乳中外泌体的可能性已被证实。凝胶过滤不适合直接从大量牛奶中分离外泌体，它可从超滤和/或超离心后获得的共分离蛋白质制剂中纯化样品。连续的离心和超速离心后用0.22 μm过滤器进行超滤不足以获得纯化的外泌体。然而，通过对超离心法获得的沉淀物进行凝胶过滤可以得到不掺杂共分离蛋白混合物的外泌体制剂。

3 牛奶外泌体的生物活性化合物

牛奶外泌体生物化学成分（包括蛋白质、脂类和核酸）明显影响治疗分子的传递。在这方面，需要对牛奶外泌体中这些分子的含量进行详细分析，也称为“外泌体学”（类似于基因组学、蛋白质组学和其他组学技术）［12］。

3.1 牛奶外泌体蛋白质

牛奶外泌体包含几种参与其形成的蛋白质：睾丸素控制膜融合，Rab GTPase与细胞骨架蛋白相互作用［13］，Alix和Tsg101 参与内吞作用［14］。此外，牛奶外泌体所含的蛋白质决定了它们生物学功能，即微小RNA的运输和对靶细胞的黏附（四跨膜蛋白CD9，CD63，CD81）。牛奶外泌体还包含例如在Wnt信号通路中出现的涉及信号转导的细胞骨架蛋白（肌动蛋白、微管蛋白、cofilin、热激蛋白和分子）。嗜乳脂蛋白、乳黏附素和黄嘌呤脱氢酶是牛奶外泌体的特异性标记物。根据不相容分泌机制，α-，β-和κ-酪蛋白和核糖体蛋白不可能存在于外泌体制剂中［15］，因此这些蛋白质不是内在成分，可以被视为牛奶外泌体的“阴性标记物”。

3.2 牛奶外泌体核酸

外泌体RNA在肠内低pH值和存在RNA酶的情况下是稳定的。牛奶mRNA 主要集中在外泌体中，而microRNA（miRNA）集中在外泌体和上清液中。通过高通量测序（NGS）和微阵列技术分析牛奶外泌体的miRNA 含量。微阵列全球表达谱分析显示，牛奶超速离心后，外泌体组分中有79 种不同miRNA，上清液中有91 种不同miRNA，有39 种miRNA 在两种组分中均有出现。进一步研究［16］表明，这些miRNA 在外泌体部分的表达水平明显高于上清液。牛奶和牛奶外泌体不同的miRNA通常具有多个靶标，并且在胎儿发育、细胞增殖、妊娠、免疫系统发育、炎症、糖代谢、胰岛素抵抗等许多过程中显示出重要的作用［17］。

3.3 牛奶外泌体脂类

外泌体是由脂质双分子层围成的囊泡。在这方面，无论是对亲水分子（与表面蛋白结合）还是疏水分子（作为脂质双层的一部分），都可以在外泌体内部和外部传递具有药理意义的化合物。众所周知，外泌体膜含有胆固醇、磷脂酰胆碱、磷脂酰肌醇、鞘磷脂和神经酰胺；大多数磷脂酰胆碱和鞘脂已被证实位于外泌体膜的外层［18］。外泌体制剂在离心和超速离心分离过程中被脂滴、脂蛋白和其他颗粒污染的问题限制了固有的外泌体脂质的研究。研究［19］表明，从细胞培养物中分离出的外泌体包含花生四烯酸、前列腺素、脂肪酸代谢酶和白三烯。因此，需要进一步研究高纯度外泌体制剂中的脂质。脂质体已广泛用作靶向递送载体已有40多年的历史。脂质体膜可以通过单克隆抗体、核酸适配体、蛋白质和小分子进行修饰以改善靶向性。改变天然外泌体膜的一种有前途的方法是将其与具有人工功能化脂质的脂质体融合。与脂质体相比，聚合物纳米粒子可能具有更高的稳定性，但是在长期给药的情况下，它们的生物相容性和安全性仍未解决［20］。牛奶外泌体的天然脂质成分比人工脂质体更具相容性且毒性更低［21］。为了提高由牛奶外泌体给药的效率，需要对外泌体的脂质组成（脂膜上的蛋白质）进行更深入的研究。修饰外泌体表面以靶向输送和延长体内半衰期是生物药理学和生物医学的一项重要任务［22］。

4 牛奶外泌体在癌症治疗中的药物递送

2016年，牛奶外泌体针对恶性肿瘤的靶向作用首次被证实。在治疗体内肺部肿瘤的细胞培养和异种移植中，载有药物的外泌体显示出比游离药物更高的功效。牛奶外泌体表现出种间耐受性，无任何不良免疫反应和炎症反应。因此，证实了牛奶外泌体的多功能性，与携带负荷和达到靶向肿瘤的能力有关［23］。在用于输送化疗药物紫杉醇的牛奶外泌体的研究中，证实了负载的外泌体的大小略有增加。同时，含有该药物的外泌体在模拟胃肠道条件下也很稳定，从而突出了它们适合口服药物的递送［24］。

南蛇藤素是一种植物来源的三萜类化合物，具有抗炎、抗增殖和抗肿瘤的活性［25-26］。然而，这种药物的使用由于其低的生物利用度和毒性而受到高度限制。在非小细胞肺癌的异种移植模型中，载有南蛇藤素的牛奶外泌体与游离南蛇藤素相比具有较高的抗肿瘤活性。同时，通过牛奶外泌体递送的南蛇藤素没有表现出明显的全身毒性［27］。在顺铂耐药卵巢癌细胞系的实验中［28］，将基于浆果花青素的制剂装载到牛奶外泌体中，显著提高了药物的抗增殖活性，这强调了外泌体封装在各种抗肿瘤药物使用中的前景。

在Clinicaltrials.gov上注册的当前试验中，还没有一项将牛奶外泌体用作药物递送系统的研究。然而，研究［23］表明使用牛奶外泌体来递送抗肿瘤药物有助于提高治疗的有效性并降低治疗的毒性，这为将牛奶外泌体用于口服治疗剂的应用开辟了极好的前景。

5 牛奶外泌体核酸的生物活性及核酸向癌细胞的传递

牛乳中主要的miRNA miR-21 靶向p57Kip2，这是一种抑制前列腺癌细胞中周期蛋白依赖性激酶的因子。乳腺癌患者血清和肿瘤组织中miR-21水平升高。P57kip2基因敲低增强了磷酸肌醇3-激酶的肿瘤相关突变变异体诱导的增殖表型。在形态发生过程中，它从细胞停滞中释放出乳腺上皮腺泡，表明乳腺miR-21 对肿瘤生长过程具有潜在的作用。

外泌体刺激健康的肠上皮细胞增殖，但不刺激肿瘤培养物。牛奶外泌体对健康细胞的孵育导致磷酸酶和紧张素同源物（PTEN）表达水平的降低，这是miR-148a 的主要靶标，牛奶外泌体中也发现了miR-148a 的成分。在miR-148a 基因敲除细胞中，牛奶外泌体抑制DNMT1 的增殖和表达。

外泌体在细胞之间转移mRNA 和miRNA 并随后介导受体细胞中靶基因表达变化的能力也凸显了它们传递外源性小干扰RNA（siRNA）的潜力。siRNA 是潜在的一种新疗法。随着对内源性RNA干扰的了解不断增加，将siRNA用作许多疾病（包括不同类型的癌症）基于核酸药物的可能性正在增加。对siRNA 进行化学修饰以供其传递是不成功的，在某些情况下，导致其生物活性的丧失并发生毒性效应。聚合物纳米颗粒、脂质和脂质体、多肽和合成纳米载体被认为是将siRNA递送到细胞的替代选择;目前最先进的给药系统是基于脂质体的。然而，这些方法从未解决非特异性靶向和免疫应答的问题。牛奶外泌体可以将内源性RNA负载到受体细胞，并保持稳定，抵抗降解。在肺癌细胞系和小鼠异种移植中，用siRNA 负载的外泌体干扰KRAS基因突变等位基因的剂量依赖性抗增殖活性被证实。

6 结语

与脂质体和其他人造纳米颗粒相比，牛奶外泌体用于药物递送的主要优势是更高的生物相容性，即较低的免疫原性和细胞毒性，这是由于外泌体的化学成分与细胞膜相似。牛奶外泌体携带的生物活性分子即使在消化道的恶劣条件下也保持稳定，这使得使用牛奶外泌体运送口服药物成为可能。牛奶外泌体组成中各种miRNA的多样性描述及其对受体细胞遗传信息的影响，为外泌体在疾病（尤其是肿瘤性疾病）的基因治疗中打开了广阔的潜力。在药物和生物活性分子的传递中起着至关重要作用的牛奶外泌体的脂质成分，还没有得到足够的研究，因此，继续进一步研究牛奶外泌体的生物化学组成具有重要意义。