寡养单胞菌膜孔蛋白D0Y85_RS06780对细菌抗生素耐药性的作用研究

刘亚豫?任钊锐?谢欣茹?王祯?王高扬?曹广祥?付加芳

摘要：目的 探究寡养单胞菌Stenotrophomonas sp. G4菌株中膜孔蛋白D0Y85_RS06780对抗生素耐药性的作用。方法 通过氨基酸序列比对和同源建模预测D0Y85_RS06780蛋白的生物学功能；采用大肠埃希菌构建D0Y85_RS06780基因的异源表达菌株，通过检测抗生素MICs探讨D0Y85_RS06780对细菌抗生素抗性的作用，同时分析外排泵抑制剂对D0Y85_RS06780功能的影响；利用分子对接软件Discovery Studio的CDOCKER技术分析D0Y85_RS06780与抗生素和外排泵抑制剂的结合情况。结果 同源分析表明D0Y85_RS06780为膜孔蛋白，异源表达D0Y85_RS06780导致重组大肠埃希菌具有多黏菌素和四环素抗性，外排泵抑制剂利血平能够抑制其功能，分子对接显示D0Y85_RS06780能结合多黏菌素、四环素和利血平。结论 Stenotrophomonas sp. G4菌株中膜孔蛋白D0Y85_RS06780與其抗生素耐药性有关。本研究将为D0Y85_RS06780与抗生素耐药性的关联提供实验证据。

关键词：寡养单胞菌；膜孔蛋白；耐药性；异源表达；分子对接

中图分类号：R917文献标志码：A

Study on the effect of cell membrane porin D0Y85_RS06780

of Stenotrophomonas sp. on bacterial antibiotic resistance

Liu Ya-yu1， Ren Zhao-rui1， Xie Xin-ru1， Wang Zhen2， Wang Gao-yang1， Cao Guang-xiang1， and Fu Jia-fang1

（1 College of Biomedical Sciences， Shandong First Medical University & Shandong Academy of Medical Sciences， Jinan 250117;

2 School of Municipal and Environmental Engineering， Shandong Jianzhu University， Jinan 250101）

Abstract Objective To explore the effect of cell membrane porin D0Y85_RS06780 of Stenotrophomonas sp. G4 on bacterial antibiotic resistance. Methods Biological function of D0Y85_RS06780 was predicted based on amino acid sequence alignment and homologous modeling; D0Y85_RS06780 gene was heterologously expressed in Escherichia coli， and its effect on bacterial antibiotic resistance was determined through MICs; The effect of efflux pump inhibitors on D0Y85_RS06780 were also analyzed through antibiotic MICs; The molecular docking was carried out according to the CDOCKER protocol of Discovery Studio to determine whether D0Y85_RS06780 can bind antibiotics and efflux pump inhibitors. Results Homologous analysis showed that D0Y85_RS06780 is a membrane porin protein. Recombinant E. coli expressing D0Y85_RS06780 obtained polymyxin and tetracycline resistance， and the polymyxin resistance could be inhibited by the efflux pump inhibitor reserpine. Molecular docking revealed that D0Y85_RS06780 could bind polymyxin， tetracycline and the efflux pump inhibitor reserpine. Conclusion Cell membrane porin D0Y85_RS06780 of Stenotrophomonas sp. is associated with bacterial antibiotic resistance. This study provides experimental evidence for further research on antibiotic resistance mechanism of cell membrane porin D0Y85_RS06780.

Key words Stenotrophomonas sp.; Membrane porin; Antibiotic resistance; Heterologous express; Molecular docking

微生物通过多种机制产生耐药性[1]，其中，细菌主动外排作用是其主要耐药机制之一[2]。根据外排泵蛋白的氨基酸序列和能量利用可分为5大类：耐药结节化细胞分化超家族（Resistance-nodulation-cell division，RND）、易化子超家族（Major facilitator superfamily，MFS）、多重耐药及毒性化合物蛋白家族（multi antimicrobial extrusion，MATE）、耐多药性家族（small multidrug resistance，SMR）和ATP结合盒超家族（ATP-binding cassette，ABC），这些外排泵广泛存在于革兰阳性菌和阴性菌中[3-9]。研究显示多数外排泵介导多重耐药性，而部分外排泵具有底物特异性[10]。除外排泵蛋白外，革兰阴性菌外膜还存在许多通道蛋白，亲水性的溶质和其他小分子物质可以通过膜孔蛋白进出细菌[11-12]。一方面，抗菌药物通过膜孔蛋白进入菌体将细菌杀死[13-14]，另一方面膜孔蛋白也可能与多重耐药密切相关[15]，但膜孔蛋白与抗生素耐药性的关联尚有待深入阐释。

嗜麦芽寡养单胞菌（Stenotrophomonas maltophilia）是重要的医源性感染菌，在重症患者和免疫缺陷患者中可引起致死性感染，其日益严重的多重耐药性加剧了临床治疗难度（Brooke JS， 2017）[16]。Stenotrophomonas sp. G4菌株为本课题组前期分离获得的一株多重耐药菌，对多种抗生素表现为抗性，其中多黏菌素MIC值>128 mg/L[17]。基因组注释显示D0Y85_RS06780为膜孔蛋白，转录组测序分析表明多黏菌素压力下D0Y85_RS06780转录水平显著上升，但其与抗生素抗性之间的关系仍然未知。本研究通过构建D0Y85_RS06780异源表达菌株，分析膜孔蛋白D0Y85_RS06780与细菌抗生素抗性之间的關联，可为阐释膜孔蛋白参与抗生素耐药机制提供依据。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

Stenotrophomonas sp. G4菌株为从污水中分离的多重耐药菌[17]，保存于本实验室。Escherichia coli DH5α菌株，购自上海昂宇生物技术有限公司。D0Y85_RS06780的异源表达菌株R06780和P06780，为本研究构建。

1.1.2 试剂和仪器

限制酶Hind Ⅲ和 Xba Ⅰ（北京Sibenzyme公司），pMD18-T载体（北京Takara公司），2×clone express（南京诺唯赞生物科技股份有限公司），Pfu DNA Polymerase（北京艾德莱生物科技有限公司），胶回收试剂盒（美国Omega公司），质粒提取试剂盒（美国Omega公司）。多黏菌素、氟苯尼考、红霉素、环丙沙星、卡那霉素、美罗培南、头孢克肟、四环素、氨苄青霉素、羰基氰化物间氯苯腙、利血平、维拉帕米、N-甲基吡咯烷酮（麦克林公司）。MTH-100型恒温混匀仪（杭州米欧仪器有限公司），P-800型酶标仪ScanReady（杭州遂真生物技术有限公司）。

1.1.3 引物

根据Stenotrophomonas sp. G4菌株基因组（GenBank号：CP031741.1）序列，通过BioXM2.6软件设计引物序列。本研究所设计的引物序列及其扩增长度见表1。

1.2 实验方法

1.2.1 D0Y85_RS06780蛋白的同源分析

通过NCBI查找D0Y85_RS06780蛋白的同源序列，采用CLUSTALW软件比对同源蛋白的氨基酸序列，利用ESPript 3软件查看比对结果[18]。

1.2.2 D0Y85_RS06780自身启动子异源表达菌株的构建

以G4菌株的基因组为模板，RS06780-F和RS06780-R为引物（表1），PCR扩增D0Y85_RS06780基因含启动子的DNA片段。采用2×clone express重组酶将PCR片段连接至 pMD18-T载体，转化到DH5α感受态细胞，用氨苄青霉素筛选转化子，提取重组载体进行Hind Ⅲ和Xba Ⅰ酶切验证以及DNA测序验证，获得异源表达D0Y85_RS06780基因（自身启动子）的R06780重组菌株。R06780重组菌株经过Hind Ⅲ和Xba Ⅰ酶切验证、PCR验证及DNA测序验证。

1.2.3 D0Y85_RS06780大肠埃希菌启动子异源表达菌株的构建

以G4的基因组为模板，以P06780-F和P06780-R为引物（表1），扩增D0Y85_RS06780的基因片段；以pMD18-T载体为模板，AP-F和AP-R为引物（表1），扩增β-内酰胺酶基因的启动子片段；切胶回收后混合上述两个PCR产物作为模板，以AP-F和P06780-R 为引物，采用Pfu DNA聚合酶扩增融合基因片段，最后加Taq DNA聚合酶在72℃继续反应30 min，使PCR产物的末端加3'-A尾巴。通过T4 DNA连接酶将PCR产物连接至 pMD18-T载体，转化到DH5α感受态细胞，用氨苄青霉素筛选转化子，提取重组载体进行HindⅢ和XbaⅠ酶切验证以及DNA测序验证，获得D0Y85_RS06780基因融合大肠埃希菌启动子的P06780重组菌株。P06780重组菌株经过HindⅢ和XbaⅠ酶切验证、PCR验证及DNA测序验证。

1.2.4 肉汤微量稀释法测定抗生素最低抑菌浓度（MICs）

R06780菌株和P06780菌株采用肉汤微量稀释法测定抗生素MICs，测定方法根据临床实验室标准研究所（CLSI 2018）指南所述[19]。抗生素包括多黏菌素、氟苯尼考、红霉素、环丙沙星、卡那霉素、美罗培南、头孢克肟和四环素。同时以携带pMD18-T载体的DH5α（18T）菌株作为对照。

1.2.5 抑制剂对抗生素MICs的影响

使用肉汤微量稀释法测定抑制剂对抗生素MICs的影响，如临床实验室标准研究所（CLSI 2018）指南所述[19]。抑制剂选择羰基氰化物间氯苯腙（CCCP）、利血平、维拉帕米和N-甲基吡咯烷酮，首先用肉汤微量稀释法测定P06780重组菌株对上述4种抑制剂的MICs，然后确定不影响P06780菌株生长的供试浓度，然后在供试浓度条件下测定抗生素MICs，同时以不加抑制剂的P06780菌株作为对照。

1.2.6 D0Y85_RS06780蛋白与抗生素和抑制剂的分子对接

从SWISS MODEL数据库进行蛋白同源建模[20]，获取核心靶蛋白结构，从Chemspider数据库获取抗生素和抑制剂小分子配体结构式[21]，用分子对接软件Discovery Studio的CDOCKER技术对接靶蛋白与小分子配体，分析D0Y85_RS06780蛋白与抗生素和抑制剂分子之间的结合情况[22]。

2 结果

2.1 D0Y85_RS06780功能注释与同源性分析

Stenotrphomonas sp. G4菌株的基因注释显示D0Y85_RS06780基因全长1212 bp，编码含402个氨基酸的蛋白。氨基酸序列分析显示，D0Y85_RS06780与S. maltophilia K279a菌株中OprO和OprP膜孔蛋白的相似性分别为96.5%和30.4%（图1），与Pseudoxanthomonas suwonensis 11-1菌株中OprO蛋白的相似性为69.1%，与Lysobacter sp. A03菌株中OprP蛋白的相似性为58%，说明D0Y85_RS06780可能为OprO类型的膜孔蛋白。

2.2 D0Y85_RS06780异源表达菌株的抗生素MICs分析

通过PCR扩增得到D0Y85_RS06780基因（含启动子区）的DNA片段（图2A），与pMD18-T载体连接获得重组载体pMD-R06780（图2B），最后转到DH5α菌株构建得到重组菌株R06780。同时通过重叠PCR获得融合大肠埃希菌启动子的D0Y85_RS06780片段（图2C），与pMD18-T载体连接获得重组载体pMD-P06780（图2D），构建得到重组菌株P06780。

肉汤微量稀释法检测R06780和P06780重组菌株的抗生素MICs，结果如表2所示。结果显示DH5α（18T）菌株的四环素MIC值为8 μg/mL，而P06780菌株（大肠埃希菌启动子）的四环素MIC值为

64 μg/mL，R06780菌株（自身启动子）的四环素MIC值为16 μg/mL，显著高于携带pMD18-T载体的DH5α（18T）菌株，说明异源表达D0Y85_RS06780会导致大肠埃希菌对四环素产生抗性。而P06780菌株（大肠埃希菌启动子）的多黏菌素和四环素MICs值分别为32 μg/mL和64 μg/mL，表明其对多黏菌素和四环素均具有抗性。此外，P06780菌株的多黏菌素和四环素MICs值显著高于R06780菌株，提示采用宿主启动子可能更有利于D0Y85_RS06780在大肠埃希菌中表达。

2.3 抑制剂对P06780菌株抗生素MICs的影响分析

羰基氰化物间氯苯腙（CCCP）、利血平、维拉帕米和N-甲基吡咯烷酮是常用的外排泵抑制剂。本研究首先通过肉汤微量稀释法测定了P06780菌株对这些外排泵抑制剂的MICs，确定0.1 μg/mL CCCP、

8 μg/mL利血平、8 μg/mL维拉帕米和8 μg/mL N-甲基吡咯烷酮不影响P06780菌株的生长，因此采用上述浓度作为供试浓度进行抑制剂试验。抑制剂对P06780菌株抗生素MICs的影响见表3，在供试浓度下CCCP、维拉帕米、N-甲基吡咯烷酮对抗生素MICs值无显著影响，而添加8 μg/mL 利血平时P06780菌株对多黏菌素的MIC下降为4 μg/mL，比不加抑制剂时的MIC值（32 μg/mL）明显降低，说明利血平能抑制D0Y85_RS06780蛋白对多黏菌素的抗性。文献显示利血平能够抑制ABC家族和MFS家族外排泵的功能[23]，提示D0Y85_RS06780可能通过发挥外排泵作用使细菌产生对多黏菌素抗性。此外，添加8 μg/mL 利血平时P06780菌株对四环素的MIC仍为64 μg/mL，与不加抑制剂时的MIC值（64 μg/mL）一致，提示利血平能不能抑制D0Y85_RS06780蛋白对四环素的抗性。

2.4 膜孔蛋白D0Y85_RS06780与抗生素的分子对接

CDOCKER分子对接显示D0Y85_RS06780蛋白可以结合多黏菌素和四环素等抗生素分子（图3）。分子对接结果显示多黏菌素可结合D0Y85_RS06780蛋白的B环Ser-364、 Lys-104、Leu-129、Phe-120、Asn-102氨基酸残基，四环素结合B环Leu-99、Val-76、Asn-102、Ser-131、Asp-100氨基酸残基，表明膜孔蛋白D0Y85_RS0678可能具有运输多黏菌素和四环素的功能，与细菌的多黏菌素和四环素抗性有关。分子对接显示外排泵抑制剂利血平也可以结合D0Y85_RS06780蛋白的B环和C环 Leu-368、Phe-366、Val-103、Lys-104、Tyr-105、Ile-115氨基酸残基，考虑到利血平可以显著降低P06780菌株的多黏菌素MIC（表3），提示利血平可与多黏菌素竞争性结合D0Y85_RS06780蛋白并抑制其运输功能。此外，D0Y85_RS06780蛋白与氟苯尼考、环丙沙星、卡那霉素、红霉素、美罗培南和头孢克肟等抗生素均不能成功对接，分子对接数据与上述抗生素MICs的结果一致（表2）。

3 讨论

膜孔蛋白与抗生素耐药性的关联尚有待深入阐释[24]。生物信息学分析表明Stenotrphomonas sp. G4菌株中D0Y85_RS06780蛋白为OprO类型的膜孔蛋白，已有的研究显示假单胞菌中OprO膜孔蛋白与其多重耐药性相关 [25-26]，提示D0Y85_RS06780可能与细菌的抗生素抗性有关。本文进一步探讨了Stenotrphomonas sp. G4菌株中D0Y85_RS06780膜孔蛋白与抗生素耐药性的关联。本研究表明异源表达D0Y85_RS06780时重组大肠埃希菌P06780的多黏菌素和四环素MICs值分别为32 μg/mL和64 μg/mL，表明D0Y85_RS06780介导了细菌的多黏菌素和四环素抗性。外排泵抑制试验分析显示添加8 μg/mL利血平时P06780菌株对多黏菌素的MIC比不加抑制剂时明显降低，提示D0Y85_RS06780可能发挥外排泵作用从而使细菌产生多黏菌素抗性。分子对接分析进一步表明多黏菌素和外排泵抑制剂利血平均能结合D0Y85_RS06780蛋白上的Lys-104氨基酸位点，上述结果表明Stenotrphomonas sp. G4中膜孔蛋白D0Y85_RS06780与细菌的多黏菌素抗性之间存在关联。但分子对接显示利血平与膜孔蛋白D0Y85_RS0678结合的氨基酸位点不同于四环素与D0Y85_RS0678结合的氨基酸位点，与抑制剂實验结果（利血平能不能降低D0Y85_RS06780蛋白对四环素的MIC值）一致，暗示D0Y85_RS0678虽具有四环素抗性但其抗性不能被利血平抑制。

P06780菌株（大腸埃希菌启动子）的多黏菌素和四环素MICs值均高于R06780菌株（自身启动子），提示膜孔蛋白D0Y85_RS06780的表达水平可能影响其对抗生素的抗性。此外，Stenotrphomonas sp. G4菌株的多黏菌素和四环素MICs值[17]与P06780菌株和R06780菌株均有较大差异，除膜孔蛋白D0Y85_RS06780在不同菌体内表达量不同的原因之外，也可能与细菌体内微环境有关，还可能与G4菌株存在其它抗生素耐药机制有关，提示细菌的抗生素抗性受到多因素的复杂影响。

细菌外排泵主动外排过程所消耗的能量来源于质子移动力（PMF）或ATP水解，研究认为SMR家族、MATE家族、MFS家族和RND家族都属于PMF型，ABC家族为ATP型[27]。研究显示外排泵抑制剂利血平会抑制ABC家族外排泵的功能[28]。尽管本文研究表明Stenotrphomonas sp. G4菌株中D0Y85_RS06780膜孔蛋白介导细菌的抗生素抗性，且其对多黏菌素的抗性可被利血平抑制，但D0Y85_RS06780能量驱动类型尚需进一步深入研究。

参 考 文 献

Rowe-Magnus D A， Guerout A M， Mazel D. Bacterial resistance evolution by recruitment of super-integron gene cassettes[J]. Mol Microbiol， 2002， 43（6）： 1657-1669.

张刚， 冯婕. 细菌固有耐药的研究进展[J]. 遗传， 2016， 38（10）： 872-880.

Coyne S， Courvalin P， Périchon B. Efflux-mediated antibiotic resistance in Acinetobacter spp[J]. Antimicrob Agents Chemother， 2011， 55（1）： 947-953.

Magnet S， Courvalin P， Lambert T. Resistance-nodulation-cell division-type efflux pump involved in aminoglycoside resistance in Acinetobacter baumannii strain BM4454[J]. Antimicrob Agents Chemother， 2001， 45（12）： 3375-3380.

Wong E W， Yusof M Y， Mansor M B， et al. Disruption of adeB gene has a greater effect on resistance to meropenems than adeA gene in Acinetobacter spp. isolated from University Malaya Medical Centre[J]. Singapore Med J， 2009， 50（8）： 822-826.

Blanc V， Salah-Bey K， Folcher M， et al. Molecular characterization and transcriptional analysis of a multidrug resistance gene cloned from the pristinamycin-producing organism， Streptomyces pristinaespiralis[J]. Mol Microbiol， 1995， 17（5）： 989-999.

Brown M H， Paulsen I T， Skurray R A. The multidrug efflux protein NorM is a prototype of a new family of transporters[J]. Mol Microbiol， 1999， 31（1）： 394-395.

Bay D C， Rommens K L， Turner R J. Small multidrug resistance proteins： A multidrug transporter family that continues to grow[J]. Biochim Biophys Acta， 2008， 1778（9）： 1814-1838.

Schuldiner S. EmrE， a model for studying evolution and mechanism of ion-coupled transporters[J]. Biochim Biophys Acta， 2009， 1794（5）： 748-762.

Li X Z， Nikaido H. Efflux-mediated drug resistance in bacteria： An update[J]. Drugs， 2009， 69（12）： 1555-1623.

Brunson D N， Maldosevic E， Velez A， et al. Porin loss in Klebsiella pneumoniae clinical isolates impacts production of virulence factors and survival within macrophages[J]. Int J Med Microbiol， 2019， 309（3-4）： 213-224.

Srinivasan V B， Venkataramaiah M， Mondal A， et al. Functional characterization of a novel outer membrane porin KpnO， regulated by PhoBR two-component system in Klebsiella pneumoniae NTUH-K2044[J]. PLoS One， 2012， 7（7）： e41505.

Li Y， Yang H， Zou X， et al. Analysis of the CYP2C19 genetic polymorphism in Han and Uyghur patients with cardiovascular and cerebrovascular diseases in the Kashi area of Xinjiang[J]. Med Sci Monit， 2014， 20： 2213-2218.

Chambers J R， Sauer K. The MerR-like regulator BrlR impairs Pseudomonas aeruginosa biofilm tolerance to colistin by repressing PhoPQ[J]. J Bacteriol， 2013， 195（20）： 4678-4688.

Brunson D N， Maldosevic E， Velez A， et al. Porin loss in Klebsiella pneumoniae clinical isolates impacts production of virulence factors and survival within macrophages[J]. Int J Med Microbiol， 2019， 309（3-4）： 213-224.

Brooke J S， Di Bonaventura G， Berg G， et al. Editorial： A multidisciplinary look at Stenotrophomonas maltophilia： An emerging multi-drug-resistant global opportunistic pathogen[J]. Front Microbiol， 2017， 8： 1511.

Li J， Liu S， Fu J， et al. Co-occurrence of colistin and meropenem resistance determinants in a Stenotrophomonas strain isolated from sewage water[J]. Microb Drug Resist， 2019， 25（1）： 317-325.

Guo R， Huang D， Ji J， et al. A novel mutation GJA8 NM_005267.5： c.124G > A， p.（E42K） causing congenital nuclear cataract[J]. BMC Ophthalmol， 2022， 22（1）： 172.

Tenover F C. Antimicrobial Susceptibility Testing Methods for Bacterial Pathogens[J]. Antimicrob Drug Resist， 2018， 46： W296-W303.

Waterhouse A， Bertoni M， Bienert S， et al. SWISS-MODEL： homology modelling of protein structures and complexes[J]. Nucleic Acids Res，2018， 46（W1）： W296-W303.

Little J L， Williams A J， Pshenichnov A， et al. Identification of “known unknowns” utilizing accurate mass data and ChemSpider[J]. J Am Soc Mass Spectrom， 2012， 23（1）： 179-185.

Rampogu S， Baek A， Son M， et al. Discovery of lonafarnib-like compounds： Pharmacophore modeling and molecular dynamics studies[J]. ACS Omega， 2020， 5（4）： 1773-1781.

Pasca M R， Guglierame P， De Rossi E， et al. mmpL7 gene of Mycobacterium tuberculosis is responsible for isoniazid efflux in Mycobacterium smegmatis[J]. Antimicrob Agents Chemother， 2005， 49（11）： 4775-4777.

Delcour A H. Outer membrane permeability and antibiotic resistance[J]. Biochim Biophys Acta， 2009， 1794（5）： 808-8016.

Modi N， Ganguly S， Bárcena-Uribarri I， et al. Structure， dynamics， and substrate specificity of the OprO porin from Pseudomonas aeruginosa[J]. Biophys J， 2015， 109（5）： 1429-1438.

Moraes T F， Bains M， Hancock R E， et al. An arginine ladder in OprP mediates phosphate-specific transfer across the outer membrane[J]. Nat Struct Mol Biol， 2007， 14（1）： 85-87.

Rahman T， Yarnall B， Doyle D A. Efflux drug transporters at the forefront of antimicrobial resistance[J]. Eur Biophys J， 2017， 46（1）： 647-653.

顧觉奋. 外排泵抑制剂研究进展[J]. 国外医药（抗生素分册），2020， 41（1）： 1-10.