非小细胞肺癌组织中CK5/6 的表达及与临床病理特征和预后的关系

郑伊平，陈献国，徐小义，李献帅，支倩雯，章艳斐

肺癌是全球范围内发病率最高的实体瘤，其中 非小细胞肺癌（NSCLC）为最常见类型，占肺癌总发生率的85%[1]。细胞角蛋白5/6（CK5/6）主要表达于含有鳞状上皮细胞的组织中，如乳腺导管肌上皮、肺支气管上皮下基底细胞等，在腺上皮细胞中几乎不表达，可用于鉴别NSCLC 组织类型—鳞癌与腺癌[2]。但研究发现[3]，CK5/6 不仅能鉴别鳞癌与腺癌，还与浸润性乳腺癌等肿瘤的恶性程度有关，可辅助预测患者预后生存情况。国外报道也指出，CK5/6 表达情况可评估睾丸间皮瘤的生物学行为特点，预测患者预后[4]。但CK5/6 表达是否与NSCLC 的恶性程度及患者预后存在关联性，相关报道较少。因此，本研究收集52 例NSCLC 患者病理及临床资料，探讨CK5/6 表达与其临床病理特征及预后的关系，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集金华市中心医院2019 年8 月至2021 年8 月52 例NSCLC 患者临床资料。纳入标准：（1）于本院胸外科行手术切除，手术病理确诊为NSCLC；（2）癌组织病理标本保存良好；（3）实验室检查等资料完整；（4）患者知情同意。排除标准：（1）术前接受放化疗、靶向治疗等抗肿瘤治疗；（2）围术期出现严重并发症；（3）出院后失访。52 例中男29 例，女23 例；年龄52 ～76 岁，平均（67.2±5.9）岁；40 例有吸烟史。本研究经金华市中心医院医学伦理审查委员会审批通过。

1.2 方法

1.2.1 病理检查 癌组织标本经4%中性甲醛固定，石蜡包埋，4m 连续切片；使用二甲苯及梯度酒精（无水乙醇、95%乙醇、75%乙醇）脱蜡，苏木素染色细胞核，随后将切片置于盐酸乙醇中分化，并置于温水中蓝化，最后使用伊红染色，梯度酒精脱水（依次为75%乙醇、95%乙醇、无水乙醇），二甲苯透明，中性树脂封片待免疫组化染色；切片常规脱蜡水化，使用高压抗原修复法将切片浸润于EDTA修复液（pH 8.0），柠檬酸盐缓冲液冲洗后，滴加3%过氧化物酶37℃孵育15 min，柠檬酸盐缓冲液冲洗3 次后滴加一抗单克隆鼠抗人CK5/6（稀释比例为1∶100），4 ℃过夜；室温下复温1 h 后滴加二抗，37 ℃孵育30 min，柠檬酸盐冲洗3 次，滴加二氨基联苯胺显色液，显色5 ～10 min；显色后冲洗，并用苏木素复染2 min，温水蓝化，最后梯度酒精脱水，二甲苯（I）及二甲苯（II）分别透明，中性树脂封片。200 倍镜下随机挑选10个视野，CK5/6 阳性表达为棕黄色，定位于细胞质及细胞膜，视野中的阳性细胞＞10%判断为标本阳性。由2 名工作年限＞5 年的病理科医生阅片，判读结果不一致时讨论得到最终结果。

1.2.2 资料收集、随访 收集患者性别、年龄等基线资料，记录病理组织类型、分化程度、临床分期等病理特征，临床分期采用国际肺癌研究协会公布的第8 版TNM 分期标准[5]。出院后持续随访观察，指导患者出现不适症状及时就诊，并每3 个月电话随访1 次，每6 个月门诊随访1 次，门诊随访时行影像学检查，监测有无复发转移，本研究截止随访时间为2022 年10 月。

1.3 统计方法 采用SPSS 24.0 软件处理数据，计数资料采用2检验或Fisher 精确概率法；采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线，Log Rank法检验组间生存时间是否存在差异。P ＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CK5/6 表达情况 52 例中，22 例癌组织CK5/6表达阳性，表达阳性率为42.31%。典型病理见图1。

图1 典型病理图片（免疫组化染色，×100）

2.2 不同临床病理特征者癌组织CK5/6 表达阳性率比较 年龄≥65 岁、有吸烟史、鳞癌、低分化、淋巴结转移及TNM 分期Ⅲ～Ⅳ期者癌组织CK5/6 表达阳性率更高（均P ＜0.05），见表1。

表1 不同临床病理特征者癌组织CK5/6 表达阳性率比较 例

2.3 肺鳞癌CK5/6 表达不同者生存情况分析 18例肺鳞癌CK5/6表达阳性者1年总生存率为100.00%（18/18），1 年无瘤生存率为77.78%（14/18）；3 例阴性者1 年总生存率及无瘤生存率均为100.00%（3/3）。肺鳞癌CK5/6 表达阳性与表达阴性者1 年总生存率差异无统计学意义（P ＞0.05），1 年无瘤生存时间差异无统计学意义（2=0.739，P ＞0.05），见图2a。

图2 NSCLC 患者无瘤生存曲线

2.4 肺腺癌CK5/6 表达不同者生存情况分析 4 例肺腺癌CK5/6 表达阳性者1 年总生存率为75.00%（3/4），1 年无瘤生存率为25.00%（1/4）；27 例CK5/6表达阴性者1 年总生存率为100.00%（27/27），1 年无瘤生存率为92.59%（25/27）。肺腺癌CK5/6 表达阳性与表达阴性者1 年总生存率差异无统计学意义（P ＞0.05），1 年无瘤生存率明显低于表达阴性者（Fisher 精确概率法，P ＜0.05）。肺腺癌CK5/6 表达阳性者无瘤生存时间明显低于表达阴性者（2=18.948，P ＜0.05），见图2b。

3 讨论

NSCLC是生存率最低的实体瘤之一，基因蛋白的异常表达与NSCLC 浸润、转移有关[6]。CK5/6 为酸性多肽物质，常在鳞状上皮细胞的细胞膜与细胞质阳性表达，单层腺上皮则常缺乏CK5/6 的表达，故可依此鉴别鳞癌与腺癌[7]。本组鳞癌患者的癌组织CK5/6 表达阳性率显著高于腺癌患者，提示CK5/6在鳞癌与腺癌中的表达存在显著差异，与目前的研究结果一致[8]。另据文献报道[9]，各组型CK 在上皮细胞内的表达水平可有所变化，但特异性组型仍保持相对不变，故分析特定组型CK 的表达，可辅助判断肿瘤分化方向，评估肿瘤的生物学行为特点。本研究结果显示，低分化、淋巴结转移、TNM 分期Ⅲ～Ⅳ期者癌组织CK5/6表达阳性率更高，提示CK5/6表达阳性时，NSCLC恶性程度更高，更易出现浸润、转移。其原因可能为：CK5/6 是细胞骨架的一部分，在维持组织及细胞结构稳定性及完整性方面发挥重要作用，CK5/6 表达升高可通过影响细胞结构参与肿瘤的浸润、迁移等生物学行为[10]。另外，CK5/6 还被发现可参与细胞凋亡等信号通路的调节[11]，也可能是其与NSCLC 恶性程度存在关联的原因。

吸烟与NSCLC的发生、发展及患者预后密不可分。有研究发现[12]，吸烟状态可影响鼠类肉瘤病毒癌基因同源物B1 的突变率，从而介导NSCLC 的发病。张国桥等[13]指出，吸烟是影响NSCLC 患者预后的独立危险因素。本研究结果显示，有吸烟史者癌组织CK5/6 表达阳性率明显高于无吸烟史者，提示吸烟还可能通过影响CK5/6 的表达，参与NSCLC的形成与进展。此外，年龄也是影响NSCLC 临床病理特征及预后的关键因素，老年患者身体机能减退，自身免疫力差，呼吸道黏膜细胞损伤风险较大，NSCLC更易进展[14]。蔡静等[15]排除吸烟对NSCLC 的影响后，发现高龄且合并慢性阻塞性肺疾病者易发生NSCLC，表明年龄是影响NSCLC 发生及发展的关键因素。本研究也发现，年龄≥65 岁者癌组织CK5/6 表达阳性率高于＜65 岁者，提示老年人群CK5/6 表达阳性率更高，可能是年龄与NSCLC 发病相关的潜在机制。

预后生存率较低是NSCLC的特点，中晚期NSCLC患者1 年总生存率可不足50%[16]。本研究结果显示，肺腺癌CK5/6 表达阳性与阴性者虽然1 年总生存率无明显差异，但表达阳性者1 年无瘤生存率及无瘤生存时间更低，提示CK5/6 表达阳性可预测肺腺癌的不良预后。CK5/6 在肺腺癌中的作用机制未知，推测可能是肺腺癌中具有鳞状上皮分化潜能的组织CK5/6 表达阳性，此类患者预后较差[17]。既往由于肺腺癌CK5/6 表达阳性率低，2 者的关联性研究鲜少，本研究发现肺腺癌CK5/6 表达阳性与不良预后有关，可为后续研究开辟新方向。然而，本研究未发现肺鳞癌患者预后与CK5/6 表达的关联性，考虑与入组样本量较少，导致检验效能偏低有关，这也是本文存在的缺陷。因此，本文结论还需后续多中心大样本量前瞻性研究的论证。

综上所述，CK5/6 在NSCLC鳞癌组织中表达显著升高，老年、有吸烟史、低分化、合并淋巴结转移及高TNM 分期者CK5/6 表达阳性率较高，且肺腺癌CK5/6 表达阳性者预后较差，临床应予以重点关注。