大果木姜子不同部位挥发油成分及其抗氧化活性分析

郭江涛，张永萍,2,3，刘 杰,2,3, ，徐 剑,2,3, ，程 纯,2,3，刘 耀,2,3

（1.贵州中医药大学药学院，贵州贵阳 550025；2.国家苗药工程技术研究中心，贵州贵阳 550025；3.贵州中药炮制与制剂工程技术研究中心，贵州贵阳 550025）

大果木姜子（Cinnamomum migaoH.W.Li）为贵州省十大苗药之一[1]，为米槁的成熟果实，民间直接将其腌制做泡菜食用，也可与绿茶、罗汉果等共同制备成植物饮料，还可作为腌制具有健脾消食功能盐皮蛋的调料，并且大果木姜子油可以用于调味、去腥，起到健脾开胃的效果，可开发为具有健脾功效的功能性食品。目前大果木姜子的精油的研究多集中于GC-MS 分析熟果中挥发油组成成分，发现1,8-桉叶素、α-蒎烯、β-蒎烯、萜品油烯等[2-4]是其主要化学成分。现代药理研究表明，大果木姜子精油具有保护心肌缺血[5]、治疗冠心病[6]、房颤[7]等作用，笔者前期研究发现大果木姜子挥发油类成分具有极好的抗氧化作用，可作为潜在的天然抗氧化剂使用[8]。

大果木姜子野生资源较少，9～11 月为采摘期，9 月的果为成熟初期的青果，11 月为熟果。现代研究为大果木姜子熟果的挥发油成分及功效研究提供了充实的数据，但忽略了大果木姜子青果、果柄及叶中挥发油成分的研究，未全面分析大果木姜子不同部位挥发油成分组成及含量差异。通过研究除熟果之外的其它部位，如青果、叶及果柄等的化学成分及抗氧化性能，可寻找到更多具有较好抗氧化活性的部位。基于此，本实验采用GC-MS 法对大果木姜子青果、熟果及其果柄、叶的化学成分进行分析，结合Nist 17 和Wiley 275 标准质谱图进行检索和匹配，并采用峰面积归一化法测定其相对含量，同时进行对比分析，并对各部位的抗氧化能力进行考察，采用Origin 软件进行相关性及聚类热图分析，以期找到更多具有抗氧化潜力的药用部位，为后续研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

大果木姜子青果、熟果、果柄、叶 经贵州中医药大学孙庆文教授鉴定为樟科樟属植物米槁Cinnamomum migaoH.W.Li 的果实、柄、叶，详细信息见表1；维生素C（纯度≥99.0%） 成都第一制药有限公司；DPPH（1,1-二苯基-2-三硝基苯肼，纯度≥97.0%） 梯希布（上海）化成工业发展有限公司；2-联氮-二-（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（ABTS）合肥博美生物科技有限责任公司；无水乙醇（乙醇质量分数≥99.7%） 天津市富宇精细化工有限公司；自制蒸馏水。

表1 大果木姜子青果、熟果、果柄、叶来源信息Table 1 Information on the source of immature fruit, mature fruit, stalk, leaf of C. migao

HP6890 型GC-MS 仪 美国Agilent 公司；98-1-B 电热套 天津市泰斯特仪器有限公司；N-1001 旋转蒸发仪 昆明信捷科技有限公司；HAD-1785 挥发油检测器 安微美星实验设备有限公司；TG18G 离心机 盐城市凯特实验仪器有限公司；HH-4 恒温水浴锅 常州澳华仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 挥发油的制备 采用水蒸气蒸馏法[2]提取挥发油，称量粉碎至35 目的大果木姜子熟果、青果、叶各200 g，果柄200 g。以水为提取溶剂按料液比（g/mL）为1:3，静态浸泡3 h 以增加有效成分的溶出，之后置于挥发油提取器中提取8 h，于挥发油测定器下端缓慢放掉水层，于水油交界处开始收集挥发油，收集上层挥发油后，高速离心（转速为13000 r/min，时间为10 min，温度为4 ℃），用移液枪吸取上层液体，即得大果木姜子熟果、青果、果柄、叶的挥发油。

1.2.2 GC-MS 分析 色谱条件：色谱柱为HP-5MS（60 m×0.25 mm×0.25 μm）弹性石英毛细管柱，初始温度70 ℃，以3 ℃/min 升温至190 ℃，再以10 ℃/min升温至310 ℃，运行时间：57 min；汽化室温度230 ℃；载气为高纯氦气（99.999%）；柱前压18.49 psi，载气流量1.0 mL/min，进样1 μL（已高速离心除去水分），分流50:1，溶剂延迟时间：6 min。

质谱条件：离子源为EI 源，离子源温度230 ℃；四极杆温度150 ℃；电子能量70 eV；发射电流34.6 μA；倍增器电压1847 V；接口温度240 ℃；质量范围29～500 amu。

1.2.3 抗氧化能力测定

1.2.3.1 DPPH·清除能力的测定 参照参考文献[9]，制备0.1 mmol/L 的DPPH 工作液。取用无水乙醇稀释得到的不同浓度（0.5、1、2、4、6、8 mg/mL）大果木姜子不同部位挥发油样品1 mL 于具塞试管中，加DPPH 溶液3 mL，摇匀置黑暗处反应30 min，在517 nm 处测定吸光度值为A1；空白组用无水乙醇代替样品溶液为A0；样品对照组用无水乙醇代替DPPH 溶液为A2，以VC作为阳性对照（质量浓度分别为2、4、6、8、10 μg·mL-1），以上实验均重复3 次。公式如下：

1.2.3.2 ABTS+·清除能力的测定 参照参考文献[9]，制备ABTS 工作液。取用无水乙醇稀释得到的不同浓度（0.5、1、2、4、6、8 mg/mL）大果木姜子不同部位挥发油样品0.5 mL 于具塞试管中，加ABTS+·工作液3.5 mL，振摇，避光6 min，于734 nm 波长处测定吸光度为A1；空白组用无水乙醇替换样品溶液为A0；样品对照组用无水乙醇替换ABTS+·工作液为A2，以VC作为阳性对照（质量浓度分别为2、4、6、8、10 μg·mL-1），以上实验均重复3 次。公式如下：

1.2.3.3 总还原能力的测定 参照参考文献[10]稍作改动，取用无水乙醇稀释得到的不同浓度（0.5、1、2、4、6、8 mg/mL）大果木姜子不同部位挥发油样品2 mL 于具塞试管中，加入0.2 mol/L pH 为6.6 磷酸盐缓冲溶液、1%铁氰化钾溶液各2.5 mL，50 ℃水浴20 min，冷却，加10%三氯乙酸2.5 mL，离心（3000 r/min，10 min）后取上清液5 mL，加5 mL 蒸馏水和0.1%三氯化铁1 mL，混匀，静置10 min 于700 nm 处测吸光值A，以VC作为阳性对照（质量浓度分别为2、4、6、8、10 μg·mL-1），以上实验均重复3 次。

1.3 数据处理

根据GC-MS 所获得的质谱信息，在NIST 17和WILEY 275 数据库进行查询，然后与计算机数据系统进行综合检索和匹配，并采用峰面积归一化法测定其相对百分含量。采用Prism 8.0 进行数据统计分析，Origin 21.0 进行相关性分析（Pearson 相关性分析），TBtools 进行聚类分析。P值取0.05，0.01 两个不同水平，所有数据均表示为平均值±标准差。

2 结果与分析

2.1 大果木姜子不同部位挥发油成分分析及比较

2.1.1 不同部位挥发油成分组成 经GC-MS 分析，大果木姜子熟果、青果、柄、叶挥发油的总离子流图见图1，成分及其相对含量详见表2。从图1 可看出不同部位挥发油成分具有显著的差异。由表2 可知，从大果木姜子不同部位挥发油中共鉴定出119 种成分，包括酮类16 种、烃类50 种、醇类34 种、醛类8 种、酚类3 种、酸类3 种、其他5 种。大果木姜子青果、熟果、果柄、叶中分别鉴定出60、66、67 和50 种成分，相对含量分别占其总挥发油的86.2%、89.365%、55.047%、64.389%。

图1 大果木姜子青果、熟果、果柄及叶挥发油的GC-MS 总离子流图Fig.1 GC-MS total ion current of the volatile oil from immature fruit, mature fruit, stalk and leaf of C. migao

表2 大果木姜子青果、熟果及其果柄、叶挥发油化学成分及其相对含量Table 2 Chemical constituents and relative contents of the volatile oil of immature and mature fruit, stalk and leaf of C. migao

2.1.2 不同部位挥发油成分类别 各类成分所占百分比及数量详见表3。可见除未知成分外，熟果、青果、果柄、叶挥发油中所含的主要化合物有烃类（29.431%、70.75%、13.694%、15.303%）和醇类（10.066%、14.683%、27.791%、9.57%），熟果和青果挥发油中烃类成分以1,8-桉叶素为主，而果柄和叶中则以δ-杜松萜烯为主。其中，果柄中醇类成分含量最高，青果挥发油中烃类成分含量最高，熟果中酸类成分含量最高（41.842%），而青果中未鉴定出酸类成分，可能是在逐渐成熟的过程中青果中的某些烃类成分逐渐转化为酸类。不同部位大果木姜子挥发油所含烃类、醇类、酮类及醛类的总体数目差异不大，但各成分类别和含量占比差异较大。

表3 大果木姜子熟果、青果、果柄、叶挥发油成分占比及数量Table 3 Volatile oil components and quantities of mature fruit, immature fruit, stalk, leaf of C. migao

2.1.3 不同部位挥发油共有成分 共有成分及其相对含量详见图2。大果木姜子熟果、青果、果柄、叶挥发油共有17 个共有成分，但相对含量占比相差较大。1,8-桉叶素在熟果挥发油（13.461%）中的含量要高于青果（11.845%）和果柄（1.27%）、叶（0.231%），而青果挥发油中α-松油醇（5.178%）的含量明显高于熟果和果柄、叶，可能是由于在逐渐成熟的过程青果中的α-松油醇异构化为1,8-桉叶素，研究表明1,8-桉叶素[11]具有抑菌、抗炎抗氧化[12]、驱蚊[13]等作用，同时还可以抑制血小板聚集，防止血栓形成[14]，抑制A549 细胞的增殖[15]；榄香醇具有很好的抑菌作用[16]，其含量青果（4.967%）＞果柄（1.754%）＞叶（1.362%）＞熟果（0.608%）；愈创醇在叶、果柄中的含量均大于1%，高于青果和熟果，可以抑制M2 巨噬细胞而达到抗肺癌的作用[17]；榄香醇与愈创醇为同分异构成分，各来源挥发油中还含有多种二者的同分异构成分，随着环境温度的改变，各成分之间可能会出现相互转化，这可能是其含量存在差异的主要原因。对伞花烃在熟果中的含量最高为2.874%，在青果及果柄、叶中均低于1%，它具有抑菌[18]、抗糖尿病[19]、舒张主动脉[20]、通过调节氧化应激反应缓解动脉粥样硬化[21]等作用；4-萜品醇在青果、熟果、果柄、叶中的含量均小于1%，但其具有很好的抑菌[22]、抗炎作用[23]；α-葎草烯具有止痒活性，并能够改善精神分裂症[24-25]。莰烯可用作为有机合成原料，在合成香料、农业及药物等领域应用广泛。综上，大多数共有成分具有一定的药理活性，但又不尽相同。

图2 不同部位挥发油共有成分堆积图Fig.2 Stacked plot of common chemical constituents of the volatile oil from different parts

青果和熟果挥发油成分共有成分为44 个，其中对伞花烃、（-）匙叶桉油烯醇、正癸酸、月桂酸的百分含量随着果实的发育呈现上升趋势；α-蒎烯、香桧烯、β-蒎烯、β-月桂烯、α-水芹烯、α-松油醇、β-水芹烯呈现下降趋势。由此可发现：随着果实的发育，烯烃类成分的百分含量逐渐降低，酸类化学成分的百分含量逐渐升高，表明酸类化合物的种类和含量随着果实的成熟而发生明显变化。果柄与熟果挥发油共有29 个共有成分，其中仅α-松油醇的含量均高于1%。在叶挥发油中，与熟果挥发油共有26 个共有成分，其中叶挥发油中正癸酸含量为6.7%，匙叶桉油烯醇含量为1.47%，熟果挥发油中正癸酸含量为28.563%，匙叶桉油烯醇含量为0.122%，只有熟果和叶挥发油中均含有以上两种化学成分。有文献报道正癸酸和匙叶桉油烯醇可能是大果木姜子抗房颤的潜在活性成分[26]，因此，后续可继续对叶中化学成分及相关抗氧化活性进行进一步的研究，以期可以扩大大果木姜子抗氧化部位。

2.1.4 不同部位挥发油特有成分 从不同部位挥发油成分的组成差异分析，熟果中含有13 个特有成分，占其挥发油成分总量的18.525%，包括酮类5 种（2.772%），烃类2 种（0.088%），醛类2 种（1.356%），醇类（0.199%）及酸类（13.279%）各1 种，其他2 种（0.831%），主要特有成分为2-壬酮（1.813%）和月桂酸（13.279%）。青果中含有10 个特有成分，占其挥发油成分总量的15.989%，包括烃类7 种（14.711%）和醇类3 种（1.278%），主要特有成分为β-水芹烯（10.831%）和双环大牻牛儿烯（1.48%）。果柄中含有16 个特有成分，占其挥发油成分总量的20.716%，包括烃类5 种（1.735%），醇类9 种（17.08%）和醛类2 种（1.901%），主要特有成分为β-桉叶醇（13.683%）、罗西叶醇（1.481%）、沉香螺醇（1.269%）、依兰醛（1.792%）及α-二去氢荜澄茄烯（1.177%）。叶中含有5 个特有成分，仅占其挥发油成分总量的0.675%，且含量均小于1%。

2.2 抗氧化能力测定结果

2.2.1 DPPH·清除能力的测定结果 由图3 可见：在挥发油的质量浓度为0.5～8.0 mg/mL 的范围内，随着质量浓度的升高，清除率也在升高，呈现出一定的量-效关系。其中，在质量浓度为8.0 mg/mL 时，熟果挥发油对DPPH.的清除率最高，为90.05%，与6 μg/mL维生素C 的清除率（92.81%）相接近；青果次之，为79.79%；果柄和叶的清除率分别为75.02%和72.73%，IC50值依次为2.391、1.727、3.182、3.092 mg/mL。熟果、青果、果柄、叶挥发油对DPPH·均有较好的清除作用，可能是因为四个部位的挥发油中均含有大量的醛、酮等还原性物质，且DPPH·是脂溶性的，恰好适用于挥发性成分抗氧化能力的测定。有文献报道1,8-桉叶素具有抗炎抗氧化的作用，且中链脂肪酸正癸酸能够降低氧化应激水平[27]，熟果挥发油中酸类成分含量高达41.842%，这也可能是其抗氧化能力较高的原因之一。质量浓度分别为2、4、6、8、10 μg·mL-1的VC对DPPH.的清除率依次为32.63%、60.18%、92.81%、94.91%、98.72%。

图3 不同浓度挥发油对DPPH·的清除率Fig.3 Scavenging rate of DPPH· of volatile oils at different concentrations

2.2.2 ABTS+·清除能力的测定结果 如图4 所示，不同浓度挥发油对ABTS+·的清除率随着质量浓度的上升而增强，在质量浓度为8.0 mg/mL 时，熟果挥发油对ABTS+·清除率最高，为84.46%，果柄挥发油的清除率最差，为56.34%；结果表明熟果、青果、果柄、叶挥发油对ABTS+·均有一定的清除作用，IC50值依次为0.9423、2.616、5.344、3.651 mg/mL。由清除率可发现不同部位的挥发油对ABTS+·的清除率明显低于DPPH·。质量浓度分别为2、4、6、8、10 μg·mL-1的VC对ABTS+·的清除率依次为68.35%、84.44%、87.83%、95.44%、98.54%。

图4 不同浓度挥发油对ABTS+·的清除率Fig.4 Scavenging rate of ABTS+· of volatile oils at different concentrations

2.2.3 总还原能力测定结果 一般来说物质的还原能力与抗氧化能力呈正相关，即还原力越强，抗氧化活性越高。因此可通过测定吸光度值来评价不同部位挥发油的总还原能力，详见图5。不同浓度挥发油的总还原能力随着质量浓度的上升而增强，在质量浓度为8.0 mg/mL 时，熟果挥发油的总还原能力最强，为1.385，果柄挥发油最差；结果表明熟果、青果、果柄、叶挥发油均具有一定的还原力，但明显小于VC对照组。质量浓度分别为2、4、6、8、10 μg·mL-1的VC的总还原能力依次为0.93、1.4、1.52、1.75、1.97。

图5 不同浓度挥发油的总还原能力Fig.5 Total reducing capacity of volatile oils at different concentrations

2.3 相关性及聚类分析结果

为了直观地展示不同部位挥发油对3 个抗氧化体系的清除效果差异，将测得清除率和还原力结果经归一化后为评价指标，利用Origin 21.0 统计分析软件进行相关性分析。图6 为相关性分析结果，图中颜色由浅灰到深灰，表明不同部位挥发油中各类成分与DPPH·、ABTS+·及总还原能力抗氧化体系的相关性越大。对比各类成分与抗氧化能力的相关性：可得烃类及酸类成分与清除DPPH·、ABTS+·能力及总还原能力呈正相关，其中酸类成分的相关性最高，分别为0.90、0.88，且具有显著性（P≤0.05）。正相关表明这两类成分在抗氧化作用中可能起到重要作用，后续实验考虑对这两类成分进行单独的抗氧化能力研究。对比各类成分之间的相关性：可以发现醛类与酚类（P≤0.05）、酮类与醛类（P≤0.01）、其它成分与醛类及酮类（P≤0.01）呈正相关并具有显著性，结合表3中各类成分含量，发现其可能存在相互促进作用。

图6 相关性分析结果Fig.6 Result of correlation analysis

图7为聚类热图分析图，同组样本相关性较高，不同组样本相关性较小，聚类图可以更加直观地分析各样本间的相关性。对全部成分及不同部位挥发油进行聚类，不同部位聚类结果显示：熟果、青果、果柄、叶四个部位挥发油可聚为两类，其中青果和熟果挥发油为第Ⅰ类，这一类中1,8-桉叶素、α-蒎烯、β-蒎烯、β-罗勒烯的含量明显较高；果柄和叶可以聚为第Ⅱ类，这一类中1-（（1R,2R,3R）-2-（3-Isopropylfuran-2-yl）-3-methylcyclopentyl）ethanone、α-松油醇、4-异丙基-6-甲基-1-四酮、石榴酚、α-白菖考烯、δ-杜松萜烯、卡达烯的含量明显较高。青果和熟果中含量明显较高的成分均为烃类，结合相关性分析中烃类成分与抗氧化能力呈现正相关的结果，说明这是青果和熟果抗氧化能力较强的原因之一。聚类结果表明青果在成分上与熟果差距不大，因此青果在一定程度上可以直接使用，而果柄和叶中挥发油的化学成分则与熟果和青果相差较大。

图7 聚类分析结果Fig.7 Result of clustering analysis

3 结论

挥发油类成分是大果木姜子的主要活性成分，本研究通过研究大果木姜子熟果、青果、果柄、叶挥发油的组成和相对含量，对比分析表明不同部位挥发油的成分组成及含量存在一定的差异。可能是由于在晒干过程中一些挥发性和易氧化或易分解的成分有损失，也可能是不同部位中成分种类及组成本身就存在差异，从而导致其抗氧化的药效物质基础发生改变。从不同部位挥发油中共检测出119 种化学成分，共有成分17 种。熟果挥发油含有66 种成分，以酸类成分为主；青果挥发油含有60 种成分，以烃类成分为主；果柄挥发油含有67 种成分，以醇类成分为主；叶挥发油含有50 种成分，以烃类成分为主，可见不同部位挥发油主要组成成分差别较大。抗氧化结果表明不同部位挥发油对DPPH·及ABTS+·均具有较好的清除作用，通过对各类成分进行抗氧化相关性分析发现共有酸类及烃类成分与抗氧化能力呈现正性相关，但相关性分析只能作为预测，因此后续实验将继续对它们的抗氧化能力进行考察，有望发现潜在的抗氧化化合物。聚类分析将青果、熟果、果柄、叶分为两类，青果和熟果为第Ⅰ类，因此青果在一定程度上也可以使用，避免了大果木姜子药材资源的浪费。果柄和叶可以聚为第Ⅱ类，其中也含有大量的挥发性成分，但与果实类相差较大，不过二者都具有较好的抗氧化活性，可以进一步的探讨其抗氧化性能，为获得天然绿色的抗氧化产品提供依据。