食盐添加对鲊广椒感官品质及细菌类群的影响

向秀连，赵慧君，王玉荣，侯强川，王 婷，杨 莹，郭 壮,

（1.湖北文理学院湖北省食品配料工程技术研究中心，湖北襄阳 441053；2.湖北文理学院乳酸菌生物技术与工程襄阳市重点实验室，湖北襄阳 441053；3.襄阳市公共检验检测中心，湖北襄阳 441001）

鲊广椒是我国西南及华中等地区常见的传统发酵食品之一，其制作主要以大米粉、辣椒和食盐等佐料混合均匀后置于陶瓷罐中密封发酵[1]。因具有酸辣的口感和特殊的香味而受到广大群众的喜爱。目前鲊广椒的制作还是以家庭作坊式为主，制作工艺和环境均较为粗放，导致品质参差不齐，难以实现产业化发展[2]。近年来针对鲊广椒的研究越来越多，邓风[3]和雷炎等[4]从不同地区的鲊广椒中分离鉴定出多株乳酸菌，并将乳酸菌再投入鲊广椒中进行纯种发酵，发现其能改善鲊广椒的品质；王玉荣等[5-6]发现鲊广椒中的细菌和真菌均能直接影响鲊广椒的滋味品质，而邹金等[7-8]通过添加谷氨酰胺转氨酶和大豆分离蛋白探究其对鲊广椒肉丸品质的影响。尽管不同的工艺均可能改善鲊广椒的品质，但食盐作为最基本的添加物，不仅可以通过调节食品渗透压控制发酵菌群的结构[9]，还能直接影响食品的滋味品质[10]。通过研究食盐的添加量，改善鲊广椒的生产工艺，对于鲊广椒的产业化具有重要的推动作用。

近年来，随着科技的迅速发展和人们对食品安全的日益关注，越来越多的新技术被应用到食品的品质评测中。Wang 等[11-12]基于电子舌和电子鼻对中国传统发酵食品豆豉的滋味和风味品质进行了数字化评价，同时采用高通量测序技术对豆豉中的细菌和真菌构成和多样性进行了解析，并关联分析了豆豉中微生物对品质的影响，为解析传统发酵制品的品质形成提供了新的思路。

本研究首先制作了不同盐浓度的鲊广椒样本，继而使用电子舌和电子鼻对滋味和风味进行评价，最后结合MiSeq 测序技术对其菌群结构和多样性进行解析。通过降维和相关性分析对鲊广椒中菌群和品质结构进行比较分析，从而探究食盐对鲊广椒品质的影响，以期为鲊广椒的安全性提升和产业化发展提供一定的理论支持。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

京山大米 湖北京和米业有限公司；二荆条辣椒（Capsicum annuumL.）、白胡椒、花椒、食盐 市售；预处理溶液、内部溶液、阳离子溶液、参比溶液、阴离子溶液 日本Insent 公司；dNTPs Mix、FastPfu Fly DNA Polymerase、5×TransStartTM FastPfu Buffer北京全式金生物技术有限公司；QIAGEN DNeasy mericon Food Kit DNA 基因组提取试剂盒 德国QIAGEN 公司。

SA402B 电子舌 日本Insent 公司；vetiri 梯度基因扩增仪 美国AB 公司；PEN3 电子鼻 德国Airsense 公司；ND-2000C 微量紫外分光光度计 美国Nano Drop 公司；Illumina MiSeq 高通量测序平台 美国Illumina 公司；UVPCDS8000 凝胶成像分析系统 美国Bio-Rad 公司。

1.2 实验方法

1.2.1 鲊广椒样本的制备 每份称取750 g 磨碎的大米粉，共计9 份；每份中分别添加225 g 切碎后的辣椒、3.15 g 白胡椒和3.15 g 花椒；将0%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%和8%（以大米粉的质量为基准，编号为A0～A8）的食盐分别添加至大米粉中，搅拌均匀进行密封发酵，并在瓶口均匀喷洒5 mL 白酒封口，于30 ℃发酵30 d。

1.2.2 基于电子舌和电子鼻技术鲊广椒品质的测定 准确称取20 g 鲊广椒和80 g 蒸馏水混合均匀后12000 r/min 离心10 min，取上清液抽滤后置于4 ℃冰箱中静置24 h，去除油层后取下清液进行滋味的测定[13]。每份样品重复测定4 次，取后3 次数据的平均值为本实验的测试数据。

准确称取15 g 鲊广椒于电子鼻样品瓶中，60 ℃水浴加热30 min，并置于室温平衡10 min 后进行风味的测定。每份样本平行测定3 次，每次测试时间为60 s，响应曲线在30 s 后趋于稳定，选取39、40 和41 s 响应值的平均值为本研究的测试数据。10 个测试电极分别为W1C（对芳香类物质灵敏）、W5S（对氢氧化物灵敏）、W3C（对芳香类物质灵敏）、W6S（对氢气有选择性）、W5C（对烷烃、芳香类物质灵敏）、W1S（对甲烷灵敏）、W1W（对有机硫化物、萜类物质灵敏）、W2S（对乙醇灵敏）、W2W（对有机硫化物灵敏）和W3S（对烷烃类物质灵敏）[14]。

1.2.3 样品微生物宏基因组DNA 提取 称取2.0 g鲊广椒样本，按照DNA 基因组提取试剂盒所提供的方法进行宏基因组DNA 提取，并对其质量进行检验。

1.2.4 细菌16S rRNA V3～V4 区PCR 扩增及测序 选用338F_806R 引物（338F：5'-ACTCCTACGGGAG GCAGCAG-3'；806R：5'-GGACTACHVGGGTWTCT AAT-3'），参照郭壮等[15]的PCR 参数进行扩增，所得扩增产物送至上海美吉生物医药科技有限公司进行测序。

1.2.5 生物信息学分析 根据双端序列的重叠关系将下机数据拼接为一条序列，对照barcode 信息对序列数据进行归并后质控。采用QIIME（v1.70）平台对质控后的有效序列进行分类学地位注释和微生物多样性解析，主要分析流程参照Ma 等[16]对奶粉中细菌微生物的分析流程。

1.3 数据处理

使用PAST 软件对不同盐浓度鲊广椒的品质结构进行解析；基于Procurstes 分析对不同盐浓度鲊广椒的菌群和品质进行共变化分析；使用Pearson 相关性分析对优势细菌属（平均相对含量大于1%）与品质指标之间的相关性及显著性进行分析，选取|r|＞0.5，P＜0.05 的相关性关系，采用Cytoscape 软件进行相关性网络图绘制。使用R 软件和Origin 2019b 软件进行数据可视化。

2 结果与分析

2.1 不同盐浓度鲊广椒滋味和风味的比较分析

使用电子舌和电子鼻对鲊广椒的品质进行了数字化评价。鲊广椒滋味指标相对强度随盐浓度的变化趋势如图1 所示。

图1 鲊广椒滋味指标相对强度的变化趋势Fig.1 Changing trend of relative intensity of taste index of Zhaguangjiao

由图1（a）可知，随着盐浓度的增加，咸味和鲜味呈现连续上升的趋势，而酸味呈现连续下降的趋势。由图1（b）可知，随着盐浓度的增加，鲊广椒的涩味、后味B（苦的回味）、苦味和后味A（涩的回味）变化不明显。

鲊广椒各风味指标相对强度随盐浓度的变化趋势如图2 所示。由图2a 和图2b 可知，W1C（对芳香类物质灵敏）、W3C（对氨气、芳香类物质灵敏）和W5C（对烷烃、芳香类物质灵敏）均呈现上升-下降-上升的趋势，W3S（对烷烃灵敏）和W6S（对氢气有选择性）则呈现先下降后上升的趋势，而W1W（对有机硫化物、萜类物质灵敏）、W2W（对有机硫化物灵敏）、W1S（对甲烷灵敏）、W2S（对乙醇灵敏）和W5S（对氮氧化物灵敏）呈现出下降-上升-下降-稳定的趋势。

图2 鲊广椒风味指标相对强度的变化趋势Fig.2 Changing trend of relative intensity of flavor index of Zhaguangjiao

2.2 不同盐浓度鲊广椒中物种组成及多样性分析

本研究进一步使用高通量测序技术对鲊广椒的多样性和物种构成进行了解析。不同盐浓度鲊广椒的α多样性指数和物种组成如图3 所示。

图3 不同盐浓度下鲊广椒细菌的α 多样性（a）和物种组成（b）Fig.3 Alpha diversity (a) and species composition (b) of bacteria in Zhaguangjiao with different salt concentration

由图3（a）可知，当盐浓度不高于3%时，香农指数和发现物种数呈现快速上升的趋势；当盐浓度在3%到7%时，两者均呈现一个轻微的下降趋势；而当盐浓度大于7%时，两者均快速下降。由图3（b）可知，鲊广椒中绝对优势菌门（平均相对含量大于1%，且在所有样本中均出现）为Firmicutes（厚壁菌门）和Proteobacteria（变形菌门），其平均相对含量分别为84.87%和13.65%。且A0、A1 和A2 样品中存在较多的变形菌门，随着盐浓度的增加，相对含量逐渐减少。由图3（b）亦可知，鲊广椒中的优势细菌属分别为Lactobacillus（乳杆菌属）、Staphylococcus（葡萄球菌属）、Pediococcus（片球菌属）、Enterobacter（肠杆菌属）、Weissella（魏斯氏菌属）和Pseudomonas（假单胞菌属），其平均相对含量分别为60.20%、9.59%、9.19%、8.16%、3.97%和3.34%。其中乳酸菌类群（乳杆菌属、葡萄球菌属、片球菌属和魏斯氏菌属）平均相对含量累计高达82.96%。值得注意的是，乳杆菌属作为鲊广椒中变化最大的细菌属，其在盐浓度较低的鲊广椒样本中含量极低，当盐浓度大于3%时，其相对含量明显上升。

2.3 不同盐浓度鲊广椒中发酵菌群与品质的相关性分析

为了进一步验证菌群对品质的影响，本研究基于主成分分析和Procurstes 分析对两者之间的关系进行了研究，结果如图4 所示。

图4 基于产品品质（a）和细菌类群（b）的主成分分析及产品品质和菌群的Procurstes 分析（c）Fig.4 Procurstes analysis (c) and principal component analysis based on quality (a) and bacteria structure (b)

基于欧式距离的主成分分析对不同盐浓度鲊广椒的品质结构进行了解析（图4a），9 个鲊广椒呈现出明显的分离聚类趋势，A3 和A4，A5、A6、A7 和A8 及剩余鲊广椒样本均自成一簇，且随着食盐添加量的不断提高，相邻盐浓度的两份鲊广椒样本距离不断减小。基于加权Uni-Frac 的主成分分析发现（图4b），不同盐浓度鲊广椒在空间排布上具有一定的规律，其中A0、A1 和A2 可归为一类，位于X 轴负方向；A3、A4、A5、A6 和A7 可归为一类，位于主成分图的右上角，而A8 为单独一类。综合图4a 和4b 可知，当盐浓度超过4%时，其感官品质和菌群结构趋于稳定，且随着盐浓度的继续增加，其无明显变化。由图4c 可知，不同盐浓度鲊广椒（基于Uni-Frac 和欧氏距离对菌群和品质的整体结构进行主成分分析）在空间排布上呈现出显著的共变化趋势（P=0.01），说明品质结构的变化与菌群结构的变化密切相关。为进一步探究菌群对鲊广椒品质产生影响的原因，本研究对优势菌属与品质指标之间的相关性和显著性进行了计算，结果如图5 所示。

图5 不同盐浓度下鲊广椒中优势菌属与品质指标相关性网络图Fig.5 Network diagram of the correlation between dominant bacteria and quality indexes of Zhaguangjiao with different salt concentration

由图5 可知，鲊广椒中有5 个优势细菌属与11 个品质指标之间存在显著相关性（|r|＞0.5，P＜0.05），每一个优势菌属均与多种品质指标之间存在显著相关。由图5 亦可知，葡萄球菌属、肠杆菌属和假单胞菌属与后味B、酸味、W3S、W5S 和W1W 呈显著正相关（r＞0.5，P＜0.05），而与丰度和鲜味等优良指标呈现显著负相关（r＜-0.5，P＜0.05）；片球菌属与后味A 和W6S 呈现显著负相关（r＜-0.5，P＜0.05），但与酸味、涩味和后味B 却呈现显著正相关（r＞0.5，P＜0.05）；乳杆菌属与丰度和鲜味等指标呈现显著正相关（r＞0.5，P＜0.05），而与酸味、W3S 和后味B 等标呈现显著负相关（r＜-0.5，P＜0.05）。

2.4 不同盐浓度鲊广椒中发酵菌群的表型和功能预测

本研究基于菌群结构的主成分分析对不同盐浓度的鲊广椒进行了分类研究，将9 个鲊广椒分为3 个聚类，不添加食盐、添加1%和2%食盐样品隶属于聚类Ⅰ，添加3%、4%、5%、6%和7%食盐的样品隶属于聚类Ⅱ，而添加8%食盐的样品则隶属于聚类Ⅲ。因聚类Ⅲ仅一个鲊广椒样本，不具有统计学意义，所以后续仅针对聚类Ⅰ和聚类Ⅱ进行研究。上述研究证实鲊广椒中细菌微生物的多样性与品质之间存在密切的联系，因此本研究进一步对鲊广椒中的细菌的表型和功能进行了预测，以便于进一步解析鲊广椒中的细菌对品质的作用机制。

由图6 可知，对鲊广椒中细菌预测的9 个表型中有7 个表型在两组之间具有显著性差异（P＜0.05），其中可移动原件、生物膜形成、革兰氏阴性菌和压力耐受性在聚类Ⅰ中的相对含量显著较高（P＜0.05），而厌氧，革兰氏阳性菌和致病潜力在聚类Ⅱ中的相对含量显著较高（P＜0.05）。但值得注意的是，隶属于聚类Ⅰ的鲊广椒中细菌在与环境适应和生长繁殖相关的表型上均优于聚类Ⅱ。这表明通过在鲊广椒的发酵过程中添加低剂量的食盐能增强发酵菌株的发酵潜力，缩短发酵时间，同时降低其致病性。

图6 鲊广椒中细菌微生物的表型预测Fig.6 Phenotypic prediction of bacterial microorganisms in Zhaguangjiao

本研究使用PICRUSt 对鲊广椒中细菌微生物的功能进行预测，并基于KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）进行了注释（图7）。本研究共注释到235 条代谢通路，通过差异分析和功能富集（P＜0.05，Z＞1.6 且Ko 的表达概率大于80%或小于20%）共甄别到7 条差异代谢通路。7 条差异代谢通路中有4 条在聚类Ⅰ显著富集，分别为脂多糖的生物合成、硝基甲苯降解、细菌趋化性和鞭毛组装，而另外3 条差异代谢通路在聚类Ⅱ显著富集，分别为光合作用、D-丙氨酸代谢和分泌细菌系统。值得注意的是，7 条差异代谢通路中有4 条差异代谢通路与代谢相关，这也说明隶属于不同聚类的鲊广椒中的细菌微生物可通过其自身代谢影响其品质。

图7 鲊广椒中细菌微生物的功能预测Fig.7 Functional prediction of bacterial microorganisms in Zhaguangjiao

3 讨论与结论

在传统发酵食品的生产过程中，食盐的添加对于发酵制品的品质有着至关重要的作用。食盐作为鲊广椒的主要添加佐料，对于鲊广椒发酵菌群和品质形成起着至关重要的作用。研究发现随着食盐比例的增加，其不仅直接导致鲊广椒的咸味和涩味的强度上升，还改变了发酵制品中的菌群结构。越来越多的研究表明，发酵食品中的菌群结构差异对其品质具有较大的影响。Mania 等[17]认为环境中的微生物对于发酵食物的发酵过程和最终品质均存在影响；张逸舒和葛东颖等[18-19]发现使用分离于鲊广椒中的乳酸菌制作鲊广椒能明显改善食物的风味和滋味品质。由此可见，添加食盐不仅能直接调节发酵制品的相关滋味的强度，还可通过影响鲊广椒中的菌群结构塑造不同滋味和风味。

鲊广椒中主要以厚壁菌门和变形菌门为主，这与王玉荣等[2]解析当阳鲊广椒中细菌多样性的结果相一致。变形菌门中包含有许多病原菌，例如大肠杆菌、幽门螺旋杆菌和沙门氏菌等，而目前已证实变形菌门的增加与轻度的炎症有关[20]。王婷婷[21]发现结肠癌患者的变形菌门相较于健康组显著偏高。Shin等[22]研究亦发现，尽管变形菌门广泛存在于人体肠道中，但其在健康人肠道中的含量相对较低，且许多疾病和营养不良均与变形菌门的大量繁殖有关。随着食盐浓度的增加，变形菌门的相对含量几乎变为零。食盐可以提升发酵食品中的渗透压，改变菌群的生存环境，相关报道也证实了食盐对于变形菌门的生长具有一定的抑制作用[23]。因乳酸杆菌属抗渗透压的能力较强[24]，在一定盐浓度范围内，随着盐浓度的增加，乳酸杆菌属的含量也明显上升。而众多的研究亦表明，乳酸杆菌属具有良好的益生特性，能够显著改善发酵制品的品质[25]。由此说明，增加发酵食品中一定量的食盐比例对发酵食品中的菌群结构影响较大，且能减少传统发酵食品中致病菌的含量，对后续鲊广椒产品的安全性和产业化推动具有重要的意义。菌群结构和品质指标的变化趋势的结果表明，通过对鲊广椒中菌群结构进行解析可以准确预判其产品品质。因此在工业化生产中通过添加发酵菌株来定制鲊广椒的品质，可以使其满足更多消费者的要求。

综合分析发现，当盐浓度为5%时，鲊广椒中的菌群结构已趋于稳定，无较大变化，而风味和滋味中的整体结构已达到最优。由此可见，在鲊广椒中添加5%的食盐可以显著改善鲊广椒的品质。