microRNA-124过表达对肺动脉高压大鼠肺血管重构的影响

朱键?陈天天?刘智勇?郑常龙

【摘要】 目的 研究过表达微RNA-124（miR-124）对肺动脉高压大鼠肺血管重构的影响及初步探索其可能机制。方法 使用野百合碱（MCT）经腹腔注射建立大鼠肺动脉高压模型，气管内滴注腺相关病毒（AAV） 介导的miR-124进行干预，记录大鼠心脏右室收缩压（RVSP）、平均动脉压和心率，实时荧光定量PCR法检测大鼠肺组织中miR-124的表达，van Gieson染色观察肺内小动脉的重构程度并计算血管外径在25～50 μm以及51～100 μm的肺小动脉的中膜/外径比值，蛋白免疫印迹法检测肺组织中IL-6与 p-STAT3的蛋白水平。结果 miR-124在肺动脉高压大鼠肺组织中呈低表达；过表达miR-124可导致肺动脉高压大鼠RVSP下降，肺内小动脉中膜/外径明显降低，肺组织中IL-6和p-STAT3的表达下调。结论 AAV介导的miR-124过表达可明显减轻肺动脉高压的大鼠的RVSP以及肺血管重构，其机制可能与下调IL-6和p-STAT3的表达有关。

【关键词】 微核糖核酸-124；肺血管重构；肺动脉高压

Effect of overexpression of microRNA-124 on pulmonary vascular remodeling in rats with pulmonary arterial hypertension Zhu Jian△， Chen Tiantian， Liu Zhiyong， Zheng Changlong. △Department of Emergency， the Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University， Guangzhou 510630， China

Corresponding author， Zheng Changlong， E-mail： zhchl5@mail.sysu.edu.cn

【Abstract】 Objective To evaluate the effect of overexpression of microRNA-124 （miR-124） on pulmonary vascular remodeling， and to unravel the potential mechanism in rats with pulmonary arterial hypertension （PAH）. Methods In the monocrotaline （MCT）-induced PAH rat models， intratracheal infusion of miR-124 carried by adeno-associated virus （AAV） was performed. The right ventricular systolic blood pressure （RVSP）， mean systolic arterial pressure and heart rate were recorded. The expression level of miR-124 in lung tissues of rats was detected by real-time quantitative PCR. The histological morphology of pulmonary arterioles was observed by van Gieson staining. The ratios of medium to outside diameter of pulmonary arterioles with vessel diameters in 25-50 μm and 51-100 μm were calculated. The expression levels of IL-6 and p-STAT3 protein in lung tissues were detected by Western blot. Results The expression level of miR-124 was down-regulated in pulmonary tissues of rats with PAH. RVSP was significantly decreased， the ratios of medium to outside diameter of pulmonary arterioles were significantly attenuated， and the expression levels of IL-6 and p-STAT3 proteins were significantly down-regulated by overexpression of miR-124. Conclusion AAV-mediated overexpression of miR-124 can significantly reduce RVSP and pulmonary vascular remodeling in rats with PAH， probably by down-regulating the expression levels of IL-6 and p-STAT3.

【Key words】 MicroRNA-124； Pulmonary vascular remodeling； Pulmonary arterial hypertension

肺動脉高压（PAH）是一种由肺血管重构引起的逐渐加重、病死率较高、预后较差的心血管疾病［1］。PAH的一个重要特征是肺微血管床进行性减少、肺小动脉重构进行性增加，导致肺的血管阻力也进行性增加，气血交换减少，缺氧进行性加重，最终导致肺动脉压明显升高和右心衰竭，严重者可致死亡［2］。目前，临床上针对肺血管张力增加的药物，如磷酸二酯酶抑制剂和内皮素受体拮抗剂，可以缓解部分PAH患者的临床症状和改善血流动力学参数，但其作用靶点并不能逆转肺血管重塑，疗效有限，无法有效降低PAH患者的病死率［3］。因此，抑制或逆转肺血管重构的治疗策略可能是治疗PAH的新方法。微RNA-124（miR-124）被发现在神经细胞中大量表达、在神经发育中具有重要作用［4］。既往研究结果表明，miR-124可抑制PAH患者的血管平滑肌细胞的增殖，并可降低肺血管成纤维细胞的增殖和迁移［5-6］。然而，通过腺相关病毒（AAV）介导miR-124持续过表达能否有效抑制外膜成纤维细胞和血管平滑肌细胞的异常增殖，从而进一步减轻肺血管重构、治疗PAH呢？miR-124在PAH中的作用及其作用机制如何亦尚不明确。因此，本研究拟用miR-124过表达的方法干预野百合碱（MCT）诱导的PAH大鼠模型，观察其对PAH大鼠肺血管重构的变化，并初步探索其可能的分子机制，为临床治疗PAH提供动物实验理论基础。

材料与方法

一、实验动物和试剂

Sprague Dawley（SD）雄性大鼠32只，无特定病原体（SPF）级，体重180～200 g，购自中山大学动物实验中心，由该中心SPF级动物房负责饲养，自由饮水、进食。本研究经中山大学实验动物伦理委员会批准（批件号：IACUC-DB-16-1113），动物实验操作均按国家相关实验动物保护标准和动物使用指南进行。

MCT购自美国Sigma公司。磷酸化信号转导和转录激活因子3（p-STAT3）、STAT3及GAPDH抗体购自美国Cell Signaling Technology公司，IL-6抗体购自英国Abcam公司。AAV-U6-ZsGreen购自汉恒生物科技（上海）有限公司。

二、实验方法

1. 实验分组与大鼠PAH模型的建立

32只大鼠按照随机数字表法分为正常对照（control）组、MCT+生理盐水（MCT）组、MCT+

AAV-绿色荧光蛋白（MCT+AAV-GFP）组和MCT+

miR-124（MCT+AAV-miR-124）组，每组8只。MCT+

NS组、MCT+GFP组和MCT+miR-124组大鼠经腹腔注射2%戊巴比妥钠（40 mg/kg）麻醉后，采用自制气管导管套管插管，分别抽取100 μL生理盐水、AAV-GFP（滴度为2.0×1015 vg/L）和AAV-miR-124（滴度分别为1.4×1015 vg/L）通过微量注射器缓慢滴入气管 （vg为病毒基因组）。1 d后，MCT+NS组、MCT+GFP组和MCT+miR-124经腹腔注射MCT（60 mg/kg）制作大鼠PAH模型。

2. 大鼠血流动力学和右心室肥厚指数的监测

MCT给药后35 d（实验终点），经腹腔注射2%戊巴比妥钠（40 mg/kg）麻醉大鼠后，分离右侧颈内静脉，置入PE-100聚乙烯导管，连接换能器测量右心室收缩压（RVSP）以反映肺动脉收缩压。随后分离出右侧颈动脉，置入PE-50聚乙烯导管测量平均收缩动脉压（mSAP）和心率（HR）。血流动力学检测后处死大鼠，分离并取出大鼠心脏和肺，4 ℃磷酸盐缓冲液冲洗干净，将左右心房剪去，分别分离出右心室（RV）、左心室及室间隔（LV+S）进行称重（本部分操作由不清楚实验分组的实验员完成以避免主观性偏倚），计算右心室与左心室加上室间隔之和的比值即为右心室肥厚指数（RVHI），RVHI=RV/（LV+S）。

3. 实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测肺组织中miR-124的表达

将约100 mg大鼠右肺组织剪碎加入1 mL含RNA降解酶的TRIzol液中，研磨裂解，随后加入氯仿提取肺组织总RNA，经纯化后用紫外分光光度法測定RNA浓度及纯度。使用RT-qPCR试剂盒进行逆转录反应，引物序列见表1，扩增条件为：50 ℃ 2 min；95 ℃ 2 min；95 ℃ 15 s；60 ℃ 32 s，40个循环。PCR扩增完成后，采用按2-ΔΔCt相对定量计算miR-124及内参U6 RNA的表达。

4. 肺动脉组织van Gieson染色

左肺组织经4%多聚甲醛-PBS液中固定，石蜡切片后行van Gieson染色，由2名研究人员在光镜下观察肺组织病理变化。在高倍镜（400倍）下观察肺血管形态，对外径在25～100 μm的肺小动脉进行拍照（为避免偏倚，拍照者对实验分组情况不知情）。使用图片处理软件测量肺内小动脉的中膜以及血管外径的长度，计算二者的比值即为中膜/外径比值。每张切片随机选取10～15个肺小动脉，分别选取血管外径在25～50 μm、51～100 μm

肺内小动脉，对其中膜/外径比值进行统计分析，以了解不同大小的肺内小动脉重构严重程度。

5. 蛋白免疫印迹法检测

取约50 mg大鼠右肺组织，剪碎后加入组织蛋白裂解液裂解，置于冰上反复充分研磨，离心后取上清液，考马斯亮蓝法测蛋白质浓度。按试剂盒说明书步骤操作，分别加入抗IL-6、GAPDH、STAT3及p-STAT3抗体（均为1∶1 000），4℃孵育过夜，洗膜后加入山羊抗兔IgG（1∶2 000）孵育，TBST溶液再次洗膜后用ECL发光液进行发光显影。凝胶成像系统拍照后，使用Image J软件对各条带进行测量和分析。

三、统计学处理

使用SPSS 23.0分析数据。计量资料经检验呈正态分布，以表示。多组间比较采用单因素方差分析，组间进一步两两比较采用LSD-t法。P <

0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、miR-124在4组大鼠肺组织中的表达

4组大鼠肺组织中miR-124表达水平比较差异有统计学意义（F = 192.843，P < 0.05）。相比于control组，miR-124在MCT+ NS组和MCT+GFP组大鼠的肺组织中表达减少（P均< 0.05）；相比于MCT+GFP组，miR-124在MCT+miR-124组大鼠的肺组织中表达增加（P < 0.05）。见图1。

二、miR-124过表达对PAH大鼠RVSP和RVHI的影响

MCT注射5周后达到实验终点时，control组大鼠均存活，MCT+NS组、MCT+AAV-GFP组和MCT+AAV-miR-124组分别有2、2、1只大鼠死亡，死亡原因考虑为右心衰竭。各组大鼠血流动力学检测及RVHI结果提示，MCT+NS组大鼠的RVSP高于control组［（71.9±9.9） vs. （23.2±1.9） mmHg，P < 0.01）；MCT+miR-124组RVSP低于MCT+GFP组［（49.3±7.7） vs. （75.1±17.9） mmHg，P < 0.01）］（图2A）。MCT+NS组大鼠右心肥厚指数（RVHI）高于control组（0.60±0.10 vs. 0.24±0.02，P < 0.01），

MCT+miR-124组RVHI低于MCT+GFP组（0.45±

0.08 vs. 0.59±0.08，P < 0.01）（图2B）。4组大鼠的平均动脉压和心率的比较差异均无统计学意义（F值分别为2.371、0.837，P均> 0.05）（图2C、D）。

三、miR-124过表达对PAH大鼠肺血管重构的影响

肺组织切片行van Gieson染色结果提示，control组大鼠肺内血管外径在25～50 μm（图3A）和51～100 μm（图3C）的小肺动脉管壁结构清楚，厚度正常，中膜未见明显增厚，MCT+NS组和MCT+AAV-GFP组肺小动脉中膜明显增厚、管腔变窄，提示MCT+NS组和MCT+AAV-GFP组大鼠肺内小动脉发生肺血管重构，而MCT+miR-124组大鼠肺动脉中膜肥厚程度明显减轻。

血管外径在25～50 μm （图3B）和51～100 μm（图3D）的肺内小动脉中膜/外径比值统计结果提示：MCT+NS组和MCT+GFP组肺内小动脉中膜/外径比值高于control组，而MCT+miR-124肺内小动脉中膜/外径比值低于MCT+GFP组。4组间比较差异有统计学意义（F值分别为33.170和49.680，P均< 0.05）。

四、miR-124过表达对PAH大鼠肺组织中IL-6和p-STAT3表达的影响

蛋白免疫印迹检测结果提示，MCT+NS组和MCT+AAV-GFP组大鼠肺组织中IL-6和p-STAT3蛋白的相对表达量高于control组（P < 0.05）；MCT+AAV-miR-124组IL-6和p-STAT3蛋白的相对表达量低于MCT+NS组和MCT+AAV-GFP组（P <

0.05），IL-6和p-STAT3蛋白在4组间比较差异有统计学意义（F值分别为21.94和31.88，P均< 0.05）。见图4。

讨 论

本研究显示，MCT经腹腔注射后可导致大鼠出现严重的PAH和肺血管重构，而采用AAV作为载体介导miR-124过表达可降低MCT诱导的大鼠右心室收缩压和肺血管重构程度。模型组IL-6和p-STAT3的表达与正常对照组相比明显上调，而miR-124的过表达可下调MCT诱导的PAH大鼠肺组织中IL-6和p-STAT3的表达，提示AAV介导的miR-124过表达降低PAH的机制可能与其下调IL-6和p-STAT3的表达有关。

miRNA是一类长度18～23 nt的非编码单链小分子RNA，参与细胞的增殖、分化和凋亡、免疫反应、肿瘤发生等多种病理生理过程［7］。miRNA在呼吸系统可通过不同的信号通路和靶点影响气道平滑肌细胞的增殖和迁移、上皮细胞的增殖和黏附、成纤维细胞增生、气道血管生成、杯状细胞的分泌和气道炎症的发生，从而影响气道重构［8］。miR-124是在神经细胞中表达最丰富的微RNA。但近年来人们发现miR-124在PAH中起着非常重要的作用［9］。多项研究发现：不管是在PAH患者还是PAH动物模型中，肺动脉外膜成纤维细胞和肺血管平滑肌细胞的miR-124表达均下调，而过表达miR-124能减轻肺血管成纤维细胞和血管平滑肌细胞的增殖和迁移［10］。本研究提示，AAV介导的miR-124的过表达降低了MCT诱导的PAH，减轻了肺内小动脉血管中膜/外径比，即改善了肺血管重构，其机制可能与miR-124的过表达抑制了肺动脉血管平滑肌细胞和成纤维细胞的异常增殖和迁移有关，其具体机制仍需更多研究明确。

STAT3是一种参与多种生物学功能的转录因子，其能将细胞外信号转导至细胞核，将靶基因的转录激活，从而促进细胞增殖、存活、凋亡和炎症［11］。多项研究表明，促炎细胞因子IL-6在PAH的发病机制中发挥重要作用［12-13］。IL-6和受体结合后，可以使STAT3的酪氨酸705位点发生磷酸化，p-STAT3可促进肺动脉平滑肌细胞的异常增殖并减少其凋亡［14］。Wang等［15］的研究发现，过表达miR-124可以通过靶向调节STAT3降低促炎细胞因子IL-6的表达。另一项研究发现在口腔扁平苔藓间充质干细胞中，miR-124-3p类似物过表达可降低IL-6和STAT3的表达，而miR-124-3p的低表达则会产生相反的结果［16］。本研究中，与control组相比，加入MCT的肺组织中p-STAT3和IL-6的表达增加。与MCT+GFP组相比，MCT+miR-124组IL-6和p-STAT3蛋白的表达均下调。这提示miR-124过表达改善MCT诱导的PAH的作用机制可能与其调节IL-6/STAT3信号通路分子的表达有关，未来仍需要更多的研究予以明确。

综上所述，AAV介导的miR-124过表达可减轻野百合碱诱导的肺动脉高压和肺血管重构，其机制可能是通過调控IL-6/STAT3信号通路实现的。本研究有望为肺动脉高压和肺血管重构的基因治疗提供实验基础。

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（收稿日期：2023-03-01）

（本文編辑：林燕薇）