基于均匀设计法探讨益气温阳活血利水中药组分防治慢性心力衰竭的剂量配比

韩杨杨 ，韩玉洁 ，王海娟 ，高凡 ，刘兴超， ，郭秋红，

1.河北中医学院，河北 石家庄 050200； 2.河北省中药组方制剂技术创新中心，河北 石家庄 050200；3.河北省高校中药组方制剂应用技术研发中心，河北 石家庄 050200

慢性心力衰竭（chronic heart failure，CHF）是由于长期多种原因导致心脏结构和/或功能的异常改变，使心脏收缩和/或舒张能力减弱，从而引起的一组复杂临床综合征，是心脏疾病发展的终末阶段[1]。近年来，中医药防治CHF取得了较好的疗效，中药不良反应相对较小、安全剂量范围大，配伍治疗可增强疗效[2]。

课题组前期研究认为，CHF为本虚标实之证，以宗气亏虚为本，血瘀、痰浊、水饮为标，基本病机为气虚、阳虚、血瘀、水停，故以益气温阳、活血利水法为治疗核心，临床及实验研究均显示疗效良好[3-5]。通过文献检索收集防治CHF的中药复方，具有益气温阳活血利水作用且出现频次≥15的中药为黄芪、桂枝、丹参、葶苈子[6]，网络药理学研究初步阐明其有效组分配伍治疗CHF的可能作用机制[7]。目前，益气温阳活血利水中药治疗CHF组方的剂量配比还处于探索阶段。因此，本研究采用主动脉弓缩窄法制备CHF大鼠模型，运用均匀设计法探讨防治CHF中药益气、温阳、活血、利水组分最佳配比，为中药组分配伍规律研究提供参考。

1 动物、仪器与试药

SPF 级雄性SD 大鼠120 只，4～8 周龄，体质量180～200 g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，动物生产许可证号SCXK（京）2016-0006，动物合格证号110011200110846981。饲养于河北中医学院SPF级实验动物中心，自由摄食饮水，12 h/12 h明暗交替，温度20～22 ℃，湿度50%～60%，隔日更换垫料。本实验已通过河北中医学院实验动物管理伦理委员会审查批准（DWLL2021039）。

Vevo2100 小动物超声成像系统（加拿大VisualSonics公司），SH-2型加热磁力搅拌器（天津市泰斯特仪器有限公司），1-15K型高速冷冻离心机（美国Sigma 公司），HT7700 型透射电子显微镜（日本Hitachi公司）。

黄芪总皂苷（含黄芪甲苷50%，批号K20495）、丹参总酚酸（含丹酚酸B 50%，批号K20386），西安开来生物科技有限公司；葶苈子水提物（按10∶1比例提取，批号FY20Y1112）、桂皮醛（含桂皮醛98%，批号FY21S0108），南通飞宇生物科技有限公司。实验时以0.5%羧甲基纤维素钠水溶液为溶剂将4种组分药物混合按实验用量加入，制成所需浓度的混悬液，置于4 ℃冰箱冷藏备用。卡托普利片（25 mg/片，批号393200204），石药集团欧意药业有限公司。将卡托普利片研磨后，用100 ℃蒸馏水和0.5%羧甲基纤维素钠配制成1.05 mg/mL药液，置于4 ℃冰箱冷藏备用。

N端脑利钠肽前体（NT-proBNP）试剂盒（上海西唐生物科技有限公司，货号F15151）；血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）试剂盒（北京北方生物技术研究所有限公司，货号D02PZB）；醛固酮（ALD）试剂盒（北京北方生物技术研究所有限公司，货号D03PZB）；肌钙蛋白T（cTnT）试剂盒（生工BBI生命科学有限公司，货号D731143）。

2 方法与结果

2.1 造模

采用主动脉弓缩窄术诱导CHF大鼠模型[8]。腹腔注射3%戊巴比妥钠（0.1 mL/100 g）麻醉大鼠，将大鼠仰卧位固定于手术台，左胸备皮并用碘伏消毒，钝性分离左胸腔第一肋间隙靠近第二肋上缘逐层打开，暴露胸腺后将胸腺推至头侧寻找主动脉弓，主动脉弓呈“H”型，将注射针头去尖并将起始大约0.5 cm弯折30°制成特制挑针，将4-0号非吸收兽用缝合线穿进特制挑针中，使用特制挑针找到主动脉弓头臂干与左颈总动脉的连接处，将垫针与主动脉弓结扎后，缓慢取出垫针。擦拭淤血后，迅速逐层缝合伤口。造模4周后检测大鼠射血分数（EF）进行评估，以EF≤50%判断造模成功。假手术组只做开胸处理。

2.2 均匀设计方案

采用U8（85）均匀设计表，以黄芪总皂苷、丹参总酚酸、桂皮醛和葶苈子水提物为考察因子，每个因子取8个水平。通过查阅文献确定各药物的剂量范围，分别为黄芪总皂苷20～60 mg/kg[9-10]、丹参总酚酸10～40 mg/kg[11-12]、葶苈子水提物50～190 mg/kg[13-14]、桂皮醛30～100 mg/kg[15-16]。根据均匀设计表设计各组给药剂量，得到均匀设计方案，见表1。

表1 益气温阳活血利水中药组分配伍均匀设计方案（mg/kg）

2.3 均匀设计筛选实验

2.3.1 分组、给药及取材

80只大鼠按体质量随机分为假手术组、模型组、不同剂量组分配伍组（均匀1～8组），每组8只。成模后，均匀1～8组按均匀设计方案分别予4种组分药物混悬液灌胃，给药体积1 mL/100 g，假手术组、模型组予等体积蒸馏水灌胃，连续8周。末次灌胃1 h后，使用小动物超声成像系统检测大鼠心功能指标；禁食禁水12 h，3%戊巴比妥钠（0.1 mL/100 g）麻醉大鼠，股动脉取血，4 ℃、3 500 r/min离心20 min，分离血清后冷藏，用于检测生化指标；剖取左心室部分组织，用4%多聚甲醛固定，用于观察心肌组织病理形态。

2.3.2 均匀设计各组对大鼠心功能的影响

大鼠吸入异氟烷（1%氧气+5%异氟烷）进行麻醉，腹部向上固定于操作台上，心前区备皮，将小动物超声成像系统探头置于大鼠胸前，以胸骨旁左室长轴和乳头肌水平短轴切面，检测心功能指标，包括EF、短轴缩短率（FS）、收缩期左室前壁厚度（LVAWs）、舒张期左室前壁厚度（LVAWd）、收缩期左室后壁厚度（LVPWs）、舒张期左室后壁厚度（LVPWd），连续检测3次，取平均值。

与假手术组比较，模型组大鼠EF、FS均降低（P＜0.05，P＜0.01）；与模型组比较，各给药组EF、FS均升高（P＜0.01）。与假手术组比较，模型组大鼠LVAWs、LVAWd、LVPWs、LVPWd均增加（P＜0.01）；与模型组比较，各给药组LVAWs、LVAWd、LVPWs、LVPWd均减小（P＜0.05，P＜0.01）。见表2。

表2 各组大鼠心功能指标比较（±s，每组8只）

表2 各组大鼠心功能指标比较（±s，每组8只）

注：与假手术组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01

?

2.3.3 均匀设计各组对大鼠血清N 端脑利钠肽前体含量的影响

全自动生化分析仪检测血清NT-proBNP含量，严格按试剂盒说明书进行操作。与假手术组比较，模型组大鼠血清NT-proBNP含量明显升高，差异有统计学意义（P＜0.01）；与模型组比较，除均匀3组外，各给药组大鼠血清NT-proBNP含量均明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）。见表3。

表3 各组大鼠血清NT-proBNP含量比较（±s，pg/mL）

表3 各组大鼠血清NT-proBNP含量比较（±s，pg/mL）

注：与假手术组比较，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01

?

2.4 最佳配比分析

采用SPSS19.0 软件，分别以NT-proBNP、EF 为因变量，黄芪总皂苷（Xa）、丹参总酚酸（Xb）、葶苈子水提物（Xc）和桂皮醛（Xd）为自变量，进行多元线性回归分析。NT-proBNP 回归方程为Y=374.439-0.01Xa+0.048Xb-0.01Xc-0.001Xd，EF 回归方程为Y=42.942+0.03Xa-0.013Xb+0.001Xc+0.003Xd。 最佳配比为黄芪总皂苷60 mg/kg，丹参总酚酸10 mg/kg，葶苈子水提物190 mg/kg，桂皮醛100 mg/kg。

2.5 验证实验

2.5.1 分组与给药

将40只大鼠按体质量随机分为假手术组、模型组、组分配伍优选组（HDTG 组，黄芪总皂苷60 mg/kg，丹参总酚酸10 mg/kg，葶苈子水提物190 mg/kg，桂皮醛100 mg/kg）、阳性药组（卡托普利10.5 mg/kg），每组10只。造模4周后，给药组给予相应药物灌胃，假手术组、模型组给予等体积蒸馏水灌胃，连续8周。

2.5.2 优选组分配伍对大鼠心重指数的影响

大鼠股动脉取血后，迅速剖离心脏组织，预冷生理盐水冲洗，滤纸吸干水分，称量心脏质量。心重指数（%）=全心质量÷体质量×100%。

与假手术组比较，模型组大鼠体质量、全心质量、心重指数均明显增加（P＜0.01）；与模型组比较，阳性药组体质量无明显差异，HDTG组和阳性药组全心质量、心重指数明显减小（P＜0.05，P＜0.01）。见表4。

表4 各组大鼠体质量、全心质量、心重指数比较（±s）

表4 各组大鼠体质量、全心质量、心重指数比较（±s）

注：与假手术组比较，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01

?

2.5.3 优选组分配伍对大鼠血浆血管紧张素Ⅱ、醛固酮及血清肌钙蛋白T含量的影响

使用半自动生化分析仪检测血浆AngⅡ、ALD及血清cTnT含量，严格按试剂盒说明书操作。

与假手术组比较，模型组大鼠血浆AngⅡ、ALD和血清cTnT含量明显升高（P＜0.01）；与模型组比较，HDTG 组和阳性药组大鼠血浆AngⅡ、ALD 和血清cTnT含量均降低（P＜0.01）。见表5。

表5 各组大鼠血浆AngⅡ、ALD及血清cTnT含量比较（±s，pg/mL）

表5 各组大鼠血浆AngⅡ、ALD及血清cTnT含量比较（±s，pg/mL）

注：与假手术组比较，**P＜0.01；与模型组比较， ##P＜0.01

?

2.5.4 优选组分配伍对大鼠心肌组织形态的影响

将4%多聚甲醛固定的心肌组织取出，常规脱水、石蜡包埋、切片，分别进行HE、Masson染色，光镜下观察心肌组织病理形态。

假手术组大鼠心肌染色均匀，肌横纹排列整齐，细胞间界限均匀清晰，细胞核形态完整；模型组染色不均匀，心肌横纹明显断裂，细胞水肿明显，心肌纤维增粗、断裂，炎性细胞浸润及成纤维细胞增生明显，细胞排列紊乱、间隙增宽，核溶解；HDTG组和阳性药组均显著缓解，心肌细胞水肿及炎性细胞浸润减少，心肌细胞排列较整齐，成纤维细胞增生改善。见图1。

图1 各组大鼠心肌组织病理形态（HE染色，×400）

与假手术组比较，模型组病理切片心肌细胞排列杂乱，出现大量蓝紫色胶原纤维明显堆积，心肌结构被破坏；与模型组比较，HDTG组和阳性药组心肌细胞排列较整齐，胶原纤维堆积情况减少。见图2。

图2 各组大鼠心肌组织病理形态（Masson染色，×400）

3 讨论

根据CHF临床症状，可将其归属于中医学“悬饮”“水肿”“喘证”“心胀”等范畴[17]，病位在心脏及血脉，与肺、脾、肝、肾等脏相关[18]，主要表现为劳力性呼吸困难、夜间阵发性呼吸困难、下肢水肿、咳嗽、食欲不振等。CHF的核心病机是虚、瘀、水，主要治法为益气温阳、活血利水[19]。益气药有明显强心作用，与温阳药配伍可使疗效更为显著；兼以去除标实，采用活血利水法使瘀血得消，水湿得化。黄芪总皂苷能改善心力衰竭大鼠心功能，延缓左室重构[20]。葶苈子水提液可改善心力衰竭大鼠心脏功能，抑制心室重构，减少心肌细胞凋亡[13]。丹参总酚酸改善心肌细胞内钙循环，增强心肌舒张和收缩功能[11]。桂皮醛可降低高血压小鼠血压，抑制血管重塑和炎症反应[21]。

NT-proBNP对于诊断和鉴别心力衰竭具有良好的特异性和敏感性。NT-proBNP水平与心力衰竭的严重程度呈正相关，为心力衰竭常用的诊断指标[22-24]。心脏超声是目前临床诊断心血管疾病及疗效评定的重要手段，其中左心室EF随心功能分级升高而降低，临床常作为评估左心室重构的重要参考指标[25]。NT-proBNP和EF可分别在CHF血液及心脏功能上反映心力衰竭的严重程度，故选择作为因变量。

本研究基于均匀设计法，制备大鼠CHF模型，以黄芪总皂苷、丹参总酚酸、葶苈子水提物、桂皮醛4种中药组分为观察对象，大鼠血清NT-proBNP含量及EF为因变量，通过多元回归分析得到该组方的最佳配比：黄芪总皂苷60 mg/kg，丹参总酚酸10 mg/kg，葶苈子水提物190 mg/kg，桂皮醛100 mg/kg。该配比中丹参总酚酸剂量较小。无论中医病程中的血瘀，还是现代医学中由左心衰竭引起右心衰竭导致体循环淤血，在疾病发展阶段中都属于晚期，故发挥活血化瘀功效的丹参总酚酸与药效为负相关，考虑与疾病进程有关。验证实验表明该配比有效。本研究结果表明，益气温阳活血利水中药组分对CHF有较好治疗效果，且有一定配比规律，可为中药组分配伍临床应用提供参考。