羌活胜湿汤指标成分含量测定方法建立及量值传递研究

高文雅 ，徐赫 ，周严严 ，赵海誉 ，王宏洁 ，边宝林 ，杨健 ，魏晓露 ，范志昆 ，司南

1.中国中医科学院中药研究所，北京 100700； 2.葵花药业集团（贵州）宏奇有限公司，贵州 六盘水 553400

羌活胜湿汤由羌活、独活、藁本、防风、甘草、川芎、蔓荆子7味药组成，是祛风胜湿止痛的代表方剂，已被国家中医药管理局《古代经典名方目录（第一批）》收录。羌活胜湿汤出自《内外伤辨惑论》，主治腰痛、项强、头痛、肩背痛等疼痛类病证[1]。后世记载羌活胜湿汤的各类中医古籍文献近百种，大多遵从《内外伤辨惑论》的方剂组成、用量、主治，延伸和扩展了该方的临床应用，以羌活胜湿汤之名沿用至今。羌活胜湿汤长于祛风胜湿止痛[2]，以辛苦温散之品为主组方，共奏祛风胜湿之效，使客于肌表之风湿随汗而解，主治风湿在表之头身重痛而表证不明显者，以头身重痛或腰脊疼痛，苔白脉浮为辨证要点。现代医家将羌活胜湿汤应用于内科、骨科、妇科等，辨证为风湿在表者均可以该方为基础方加减治疗[1]，适用于风湿性关节炎、类风湿关节炎、骨质增生症、强直性脊柱炎等属风湿在表者[3]，充分体现了异病同治的中医特点，具有重要的临床应用价值和意义。

目前，羌活胜湿汤尚无成药流通于市场，对该方的研究多集中于临床应用方面，有研究者采用HPLC建立了羌活胜湿汤的指纹图谱[4-5]，但鲜有反映该方含量测定的研究。因此，为更好地控制羌活胜湿汤的质量，本研究运用HPLC，以升麻素苷、甘草酸、异欧前胡素、阿魏酸、蛇床子素为指标成分建立多成分含量测定方法，为全面控制羌活胜湿汤的质量提供依据。

1 仪器与试药

LC-2030C 3D 高效液相色谱仪，日本岛津公司；KQ-250B型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；YS-04B-小型高速粉碎机，北京燕山正德机械设备有限公司；XA105 型十万分之一、ML-104T/02型万分之一分析天平，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；2L美味世家煎药锅电砂锅，永达基电器厂；C21-WT2112T、 SK2106 C21-SK2105、 RT-2135 C21-RT2135美的多功能电磁炉，广东美的生活电器制造有限公司；CHRIST ALPHA 1-2LD PLUS台式冻干机，德国CHRIST公司。

升麻素苷、甘草酸铵、异欧前胡素、阿魏酸、蛇床子素、羌活醇、5-O-甲基维斯阿米醇苷、甘草苷对照品，中国食品药品检定研究院，批号分别为111522-201712、 110731-200615、 111827-201812、 110733-201614、 111822-201710、 111820-201705、 111523-201610、111610-201607，纯度分别为98%、99%、99.5%、99.0%、99.5%、99.9%、96.1%、93.1%。色谱级乙腈、甲醇，质谱级甲酸，赛默飞世尔科技（中国）有限公司；娃哈哈纯净水。

羌活、独活、藁本、防风、甘草、川芎、蔓荆子药材及饮片均由葵花药业集团（贵州）宏奇有限公司提供，经中国中医科学院何希荣主管药师鉴定，分别为伞形科植物羌活Notopterygium incisumTing ex H. T.Chang 的干燥根茎和根，伞形科植物重齿毛当归Angelica pubescensK Maxim. f.biserrataShan et Yuan的干燥根，伞形科植物辽藁本Ligusticum jeholenseNakai et Kitag.的干燥根茎和根，伞形科植物防风Saposhnikovia divaricata（Turcz.）Schischk.的干燥根，豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensisFisch.的干燥根，伞形科植物川芎Ligusticum chuanxiongHort.的干燥根茎，马鞭草科植物单叶蔓荆Vitex trifoliaL. var.simplicifoliaCham.的干燥成熟果实。药材产地信息见表1。各药材均按2020年版《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》）方法加工成饮片。

表1 羌活胜湿汤组方药物来源

2 方法与结果

2.1 羌活胜湿汤基准样品制备

15批组方药物饮片随机组合，称取羌活4 g、独活4 g、藁本2 g、防风2 g、炙甘草2 g、川芎2 g、蔓荆子1.2 g粉碎制成的最粗粉于不锈钢锅中，加水400 mL，浸泡30 min，1 600 W加热至沸腾，调至500 W，煎煮35 min，趁热过滤，滤液冷冻干燥至干，粉碎，即得。

2.2 含量测定方法建立

2.2.1 色谱条件

采用SilGreen C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相为乙腈（A）-0.2%甲酸（B），梯度洗脱（0～40 min，2%～25%A；40～70 min，25%～45%A；70～80 min，45%～60%A；80～90 min，60%～100%A；90～100 min，100%A），流速1 mL/min，进样量20 μL，柱温35 ℃，检测波长254、328 nm。

2.2.2 供试品溶液制备

精密称取基准样品粉末0.1 g，置具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇水溶液25 mL，称定质量，密塞，超声（功率250 W，频率40 kHz）提取15 min，放凉，补足减失质量，摇匀，0.22 μm微孔滤膜过滤，即得。

2.2.3 方法学考察

2.2.3.1 空白试验

根据2020年版《中国药典》各药含量测定项下描述，升麻素苷、阿魏酸、甘草酸、蛇床子素、异欧前胡素分别为防风、藁本、川芎、炙甘草、独活及羌活的指标成分。色谱图比对结果显示，基准样品中阿魏酸来源主要为藁本、川芎和羌活。按“2.1”项下方法分别制备防风阴性、羌活阴性、独活阴性、藁本+川芎+羌活阴性和炙甘草阴性对照基准样品。各阴性对照基准样品按“2.2.2”项下方法分别制备相应阴性对照溶液，进行分析，色谱图见图1。该色谱条件下各阴性对照均无干扰，出峰良好，表明方法专属性良好。

图1 羌活胜湿汤基准样品及其组方药物阴性对照基准样品HPLC图谱比对

2.2.3.2 线性关系考察

精密称取升麻素苷1.81 mg、蛇床子素1.30 mg、异欧前胡素2.82 mg、甘草酸铵5.20 mg、阿魏酸18.91 mg于50 mL容量瓶中，用甲醇稀释后得系列混合对照品溶液，精密吸取混合对照品溶液10 μL注入液相色谱仪，每个浓度连续进样3次，测定峰面积，以对照品浓度（mg/mL）为横坐标，对照品峰面积为纵坐标进行线性回归，绘制标准曲线。于254 nm波长处对升麻素苷、甘草酸、异欧前胡素进行检测，328 nm波长处对阿魏酸、蛇床子素进行检测，结果升麻素苷、甘草酸、异欧前胡素、阿魏酸和蛇床子素5种成分均在相应范围内线性关系良好，见表2。

表2 羌活胜湿汤基准样品中5种成分线性关系考察结果

2.2.3.3 精密度试验

取羌活胜湿汤基准样品（批号JZYP-01），按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件连续测定6次，升麻素苷、甘草酸、异欧前胡素、阿魏酸、蛇床子素峰面积RSD 分别为0.10%、0.12%、0.34%、0.10%、0.16%，结果表明该方法精密度良好。

2.2.3.4 重复性试验

精密称取羌活胜湿汤基准样品（批号JZYP-01）6 份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件进样，同时测定升麻素苷、甘草酸、异欧前胡素、阿魏酸和蛇床子素5种成分峰面积，RSD 分别为0.23%、0.40%、1.04%、0.24%、0.76%，结果表明该方法重复性良好。

2.2.3.5 稳定性试验

取重复性试验项下供试品溶液，于室温放置，按“2.2.1”项下色谱条件分别于0、4、8、12、20、24、30、36 h进样，测定各指标成分的峰面积，升麻素苷、甘草酸、异欧前胡素、阿魏酸、蛇床子素峰面积的RSD 分别为0.21%、0.28%、0.48%、0.26%、0.25%，表明供试品溶液中5种被测成分含量至少在36 h内稳定性良好。

2.2.3.6 加样回收率试验

精密称取5种对照品，用甲醇溶液制成每mL分别含有升麻素苷1.04 μg、甘草酸铵9.96 μg、异欧前胡素0.26 μg、阿魏酸3.02 μg、蛇床子素1.24 μg的溶液，即得加样溶液。精密称取羌活胜湿汤基准样品（批号JZYP-01）0.05 g，共6份，按“2.2.2”项下方法（其中70%甲醇溶液用上述加样溶液替代）制备供试品溶液，进行分析，计算回收率。结果升麻素苷、甘草酸、异欧前胡素、阿魏酸和蛇床子素平均回收率分别为101.84%、96.61%、96.98%、98.93%、97.41%，RSD分别为1.95%、2.72%、1.98%、1.83%、1.71%，符合方法学要求。

2.3 样品测定及成分传递

2.3.1 样品含量测定

取按“2.1”项下方法制备的15批羌活胜湿汤基准样品（JZYP-01～JZYP-15），按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，测定，计算升麻素苷、甘草酸、异欧前胡素、阿魏酸及蛇床子素5种成分含量，结果见表3。按羌活胜湿汤基准样品干燥品计算，升麻素苷、甘草酸、异欧前胡素、阿魏酸、蛇床子素含量分别为0.37～0.51 mg/g、4.81～6.11 mg/g、0.07～0.18 mg/g、1.30～1.74 mg/g、0.42～0.78 mg/g。

表3 15批羌活胜湿汤基准样品5种成分含量测定结果（mg/g）

2.3.2 饮片-基准样品指标成分传递

计算指标成分转移率（基准样品中含量与饮片中含量的比值），15批饮片-基准样品的传递结果见表4。可见，由饮片到基准样品的过程中，脂溶性较强的异欧前胡素和蛇床子素的转移率低于10%，升麻素苷及甘草苷的转移率均大于50%。

表4 15批羌活胜湿汤饮片-基准样品指标成分转移率（%）

3 讨论

羌活为伞形科植物羌活Notopterygium incisumTing ex H. T. Chang 或宽叶羌活Notopterygium franchetiiH. de Boiss.的干燥根及根茎，羌活的历代本草沿革与2020年版《中国药典》的功能主治、采收加工及产地信息基本一致。通过实地调研，发现野生品多为羌活，而种植品种多为宽叶羌活。在市场流通领域调研药材采收过程，发现市场以羌活Notopterygium incisumTing ex H. T. Chang为主流流通品种。在本研究的色谱条件下，笔者发现羌活和宽叶羌活中羌活醇与异欧前胡素的含量存在明显差异，与文献报道[6]一致。提示使用不同基源的药材可能使指标性成分的含量范围波动。结合上述历史沿革及市场流通情况考证结果，羌活胜湿基准样品所用的羌活药材基原确定为伞形科植物羌活Notopterygium incisumTing ex H. T. Chang。

国家中医药管理局《古代经典名方目录（第一批）》所载羌活胜湿汤组成及剂量为羌活、独活各一钱，藁本、防风、甘草（炙）、川芎各五分，蔓荆子三分。由于历史的变迁，度量衡不尽相同。《方剂学》羌活胜湿汤的表述为：羌活、独活各一钱（6 g），藁本、防风、甘草（炙）各五分（3 g），蔓荆子三分（2 g），川芎二分（1.5 g）[7]，可见其换算比例为：1钱=6 g，1两=60 g。现代度量衡中，1两=50 g。《中国历代度量衡简表》中，金代1钱约为4 g，1两约为40 g。文献普遍认为宋代1两为40～41.3 g[8-13]。金代与宋度量衡基本一致，因此按该方法折算，处方用量为：羌活、独活各一钱为4 g，藁本、防风、炙甘草、川芎各五分为2 g，蔓荆子三分为1.2 g。

羌活胜湿汤的组方药味在2020年版《中国药典》有HPLC含量测定项目的成分为羌活醇、异欧前胡素、蛇床子素、二氢欧山芹醇当归酸酯、阿魏酸、升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、甘草苷、甘草酸及蔓荆子黄素。前期试验对处方中7味药的10个成分含量进行了初步测定，分析其HPLC图谱的分离情况。甘草苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、羌活醇有杂峰干扰，分离情况不好；蔓荆子黄素峰形好、无干扰，但峰极小。升麻素苷、阿魏酸在328 nm波长处，甘草酸在254 nm波长处峰形好且无干扰。蛇床子素及异欧前胡素在2个波长处均峰形好且无干扰。根据分析结果，秉持尽量多地体现处方药味的原则，通过方法学验证，最终选择异欧前胡素（羌活）、蛇床子素（独活）、阿魏酸（藁本、川芎）、升麻素苷（防风）及甘草酸（甘草）5种成分进行含量测定。后续将建立羌活胜湿汤特征图谱，对蔓荆子药味进行质量控制。

考察不同色谱柱（SilGreen、YMC Hydrosphere C18）及不同色谱仪（安捷伦1260、岛津LC-2030C、岛津LC20A）对5种成分测定的系统适用性。由于基准样品成分复杂，用同一色谱条件进行含量测定过程中，除个别型号色谱柱拖尾因子略有逸出外，该方法系统适用性良好。根据3种仪器多个不同色谱柱的实验结果，同时参照2020年版《中国药典》规定，限制本方法中理论塔板数，按升麻素苷峰计应不低于2 000。

从饮片-基准样品指标成分传递结果可以看出，由水提浓缩制成的基准样品，水溶性成分提取率高，而脂溶性成分提取率低。阿魏酸是2020年版《中国药典》藁本及川芎的含量测定指标成分，然而仅针对这2味药进行质量传递考察得到的传递率为155.64%，大于100%。经HPLC图谱比对，本处方羌活中阿魏酸峰较为明显，含量较高。但阿魏酸不是2020年版《中国药典》羌活药材的含量测定指标成分，故未将其纳入转移率计算。后续将建立羌活药材及饮片中阿魏酸含量测定方法，对羌活胜湿汤基准样品中阿魏酸的转移率进行补充。

按照药典通则描述，对羌活胜湿汤基准样品分别进行高温（60 ℃）、高湿（相对湿度90%±5%）及强光照射（4 500 lx±500 lx）试验，于第5、10日取样检测。结果发现在高湿条件下（湿度92.5%、1～2 d；75%、2～3 d）样品吸潮明显、呈果冻状，不适合检测；高温（60 ℃）及强光照射条件下，异欧前胡素及蛇床子素的含量均相应减少。因此，对羌活胜湿汤基准样品贮存条件应为遮光、密封、防潮。

本研究建立了在同一HPLC条件下同时测定经典名方羌活胜湿汤基准样品中5种指标成分含量方法，通过全面方法学验证，简便易行，可为全面控制该方质量提供依据。