电针心包经穴对脑缺血大鼠不同时点脑组织Nogo-A及NgR1蛋白表达的影响

肖豆 ，马文娟 ，唐雅妮 ，谢峥嵘 ，潘江 ，刘民权 ，章薇 ，陈成

1.同济大学附属杨浦医院，上海 200090； 2.长沙市中医医院，长沙市第八医院，湖南 长沙 410100；3.长沙民政职业技术学院，湖南 长沙 410004； 4.湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 410007

脑缺血是因大脑血液循环受阻，缺血、缺氧导致局限性脑组织缺血性坏死或软化，进而引起相应神经系统功能缺损的一种疾病。患者脑缺血后多伴有肢体功能障碍，甚至造成终身残疾。神经修复是促进脑缺血患者神经功能康复的重要途径[1]。研究认为，神经功能因子及炎症介质的相互作用是影响神经修复的关键因素[2]。其中髓鞘相关生长抑制因子A（Nogo-A）与Nogo 受体1（NgR1）均具有抑制神经细胞迁移和扩散、阻碍轴突再生的作用[3-4]，通过消除或减少上述抑制因子，能达到促进神经再生及脑缺血后中枢神经修复的作用[5-6]。本研究基于Nogo-A/NgR1信号通路观察电针心包经穴对大脑中动脉栓塞（MCAO）模型大鼠不同时点脑组织Nogo-A及NgR1蛋白表达的影响，探讨电针对脑缺血损伤后神经修复的作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物

SPF 级雄性SD大鼠150只，体质量220～250 g，3～4月龄，湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，动物许可证号SCXK（湘）2016-0002。饲养于温度22 ℃、湿度55%～70%环境。实验过程遵守实验动物管理和使用规定。

1.2 主要试剂与仪器

Nogo-A抗体（美国Proteintech公司，货号10740-1-Ap），NgR1 抗体（博奥森公司，货号bs-0129R），β-actin抗体（美国Proteintech公司，货号66009-1-Ig），二抗鼠抗体（美国Proteintech公司，货号SA00001-1），二抗兔抗体（美国Proteintech公司，货号SA00001-2），RIPA裂解液（上海碧云天公司，货号P0013B）。

0.30 mm×15 mm华佗牌毫针、SDZ-Ⅱ华佗电针治疗仪（苏州医疗用品厂有限公司），DYY-6C 电泳仪（北京六一仪器厂），YD-315切片机（浙江金华益迪试验器材），DYCZ-40D转膜仪（北京六一仪器厂）。

1.3 分组与造模

将150只SD大鼠随机分为正常组、假手术组、模型组、心包经组和肺经组，每组30只，各组再分为3、7、14、21、28 d 5个时间点，每个时间点各6只。

造模前禁食1 d，参照Longa[7]和Koizumi[8]造模方法，以颈外动脉插入线栓法制备MCAO大鼠模型。正常组不做任何处理，假手术组仅暴露血管。造模后次日，采用Longa 5级4分制评分法[7]评分：无神经功能缺损计0分，缺血对侧伸直障碍、前爪内收计1分，行走向偏瘫侧转圈计2分，行走向偏瘫侧倾倒计3分，完全丧失意识、不能行走计4分。选取评分1～3分大鼠纳入实验。

1.4 干预

造模成功次日开始电针干预，参照《实验针灸学》[9]动物穴位图谱取穴。心包经组选取“天泉”“曲泽”“内关”“大陵”，肺经组选取“天府”“尺泽”“列缺”“太渊”，用毫针刺入缺血对侧穴位3～4 mm，接通电针治疗仪，心包经组“天泉”“曲泽”相连、“内关”“大陵”相连，肺经组“天府”“尺泽”相连、“列缺”“太渊”相连，选用连续波，电压2～4 V，电流4～6 mA，强度以局部组织轻颤为度。每次30 min，每日1次，连续6 d，休息1 d，继续干预至28 d。

1.5 HE染色

分别于电针3、7、14、21、28 d取相应大鼠，颈椎脱臼处死，断头取脑，参照《大鼠脑立体定位图谱》[10]，模型组、心包经组和肺经组切取左侧视交叉至脑桥属大脑中动脉供血区域，正常组和假手术组参照上述部位取材。脱水、包埋、切片后，60 ℃烤片1～2 h，切片置于二甲苯中10 min×2 次。100%、100%、95%、85%、75%乙醇依次放置5 min，蒸馏水洗5 min，苏木素染色5～10 min，蒸馏水冲洗，PBS返蓝，伊红染3～5 min，蒸馏水冲洗，梯度乙醇脱水，置于二甲苯中10 min×2次，中性树胶封片，显微镜下观察。

1.6 免疫组化染色

取大鼠缺血侧脑组织，用4%多聚甲醛固定，常规制作石蜡切片，切片脱蜡至水，浸入柠檬酸盐缓冲液，微波炉加热至沸腾，连续煮25 min，冷却至室温，PBS洗涤3 min×3次进行热修复抗原，灭活内源性酶后，滴加Nogo-A、NgR1 一抗（1∶200），4 ℃孵育过夜。PBS冲洗5 min×3次，加二抗，37 ℃孵育30 min，PBS冲洗5 min×3次，DAB显色，苏木素复染5～10 min，蒸馏水冲洗，PBS返蓝后显微镜下观察，随机选择5个不重叠视野采集图像，Image-Pro Plus 6.0软件分析每个视野阳性表达的平均光密度（阳性染色为棕黄色）。

1.7 Western blot检测

取缺血侧脑组织，每100 mg组织加入RIPA裂解液1 mL研磨，冰上裂解10 min，4 ℃、12 000 r/min离心15 min，吸取上清液，BCA法测定蛋白浓度。加入上样缓冲液加热变性后，电泳，转移至NC膜，用5%脱脂奶粉室温封闭60 min，分别加入Nogo-A一抗（1∶800）、NgR1一抗（1∶1 500）、β-actin一抗（1∶5 000），4 ℃孵育过夜，加入相应二抗（1∶5 000），室温孵育90 min。使用ECL化学发光液显影，用Quantity One软件分析蛋白条带灰度值。以β-actin为内参，计算目的蛋白相对表达量（目的蛋白灰度值/β-actin灰度值）。

1.8 统计学方法

2 结果

2.1 电针对模型大鼠缺血侧脑组织病理变化的影响

正常组、假手术组大鼠各时点脑组织结构完整、清晰致密，神经元细胞胞质丰富，可见较大清晰核仁；模型组大鼠各时点脑组织可见大片梗死灶，神经细胞消失或皱缩，细胞核固缩，核边集严重，细胞间距增大，间质染色稀疏；心包经组和肺经组大鼠各时点缺血脑组织细胞排列相对规则，较模型组结构紧密。心包经组脑组织结构较同时点肺经组稍紧密、细胞排列稍规则。结果见图1。

图1 各组大鼠缺血侧脑组织形态（HE染色，×400）

2.2 电针对模型大鼠缺血侧脑组织髓鞘相关生长抑制因子A、Nogo受体1表达的影响

免疫组化结果显示，与正常组、假手术组比较，模型组大鼠各时点脑组织Nogo-A、NgR1表达明显升高（P＜0.01）；与模型组比较，心包经组和肺经组大鼠各时点脑组织Nogo-A、NgR1表达明显降低（P＜0.05，P＜0.01）；与肺经组比较，心包经组大鼠7、28 d脑组织Nogo-A表达明显降低（P＜0.05，P＜0.01），各时点NgR1表达明显降低（P＜0.05，P＜0.01）。见图2、图3、表1、表2。

表1 各组大鼠缺血侧脑组织不同时点Nogo-A表达比较（±s，平均光密度）

注：与正常组、假手术组比较，★★P＜0.01；与模型组比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；与肺经组比较，●P＜0.05，●●P＜0.01

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表2 各组大鼠缺血侧脑组织不同时点NgR1表达比较（±s，平均光密度）

表2 各组大鼠缺血侧脑组织不同时点NgR1表达比较（±s，平均光密度）

注：与正常组、假手术组比较，★★P＜0.01；与模型组比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；与肺经组比较，●P＜0.05，●●P＜0.01

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图2 各组大鼠缺血侧脑组织Nogo-A阳性表达（免疫组化染色，×400）

图3 各组大鼠缺血侧脑组织NgR1阳性表达（免疫组化染色，×400）

Western blot结果显示，与正常组、假手术组比较，模型组大鼠各时点脑组织Nogo-A、NgR1蛋白表达明显升高（P＜0.01）；与模型组比较，除14 d外，心包经组大鼠脑组织Nogo-A蛋白表达明显降低（P＜0.05，P＜0.01），各时点NgR1蛋白表达明显降低（P＜0.01）；与肺经组比较，心包经组大鼠3、7 d脑组织Nogo-A蛋白表达明显降低（P＜0.01，P＜0.05），各时点NgR1蛋白表达明显降低（P＜0.01）。见图4、表3、表4。

表3 各组大鼠缺血侧脑组织不同时点Nogo-A蛋白表达比较（±s，相对表达量）

表3 各组大鼠缺血侧脑组织不同时点Nogo-A蛋白表达比较（±s，相对表达量）

注：与正常组、假手术组比较，★★P＜0.01；与模型组比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；与肺经组比较，●P＜0.05，●●P＜0.01

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表4 各组大鼠缺血侧脑组织不同时点NgR1蛋白表达比较（±s，相对表达量）

表4 各组大鼠缺血侧脑组织不同时点NgR1蛋白表达比较（±s，相对表达量）

注：与正常组、假手术组比较，★★P＜0.01；与模型组比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；与肺经组比较，●P＜0.05，●●P＜0.01

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图4 各组大鼠缺血侧脑组织Nogo-A、NgR1蛋白免疫印迹

3 讨论

脑缺血是危害人类健康的主要疾病之一，且发病年龄呈现年轻化趋势[11-12]。研究发现，脑缺血后，因脑部缺血、缺氧和系列炎症反应导致神经细胞损伤，使患者出现严重的神经功能障碍[13]。促进神经修复成为脑缺血患者后期康复的重点和难点。电针作为中医传统针刺疗法与现代电刺激相结合的治疗方式，在脑缺血康复治疗中疗效显著，其作用机理是目前研究的热点。

电针能有效调控内环境中神经生长因子和神经生长抑制因子含量[14]，改善脑组织血液循环[15]和能量代谢[16]，抑制细胞凋亡[17-18]和炎症反应[19]。但目前对于脑缺血的研究大多基于“通督调神”“治痿独取阳明”等理论开展，电针心包经与其他经脉对照的研究报道较少。从经脉循行来看，心包经可通过其络脉、阴维脉、任脉与脑间接联系。且《针灸甲乙经》《针灸大成》《外台秘要》《铜人腧穴针灸图经》等古籍皆记载心包经腧穴可治疗中风诸症[20]。临床研究表明，针刺心包经腧穴不仅能有效增加脑缺血患者脑血流量[21]，调节自主神经平衡[22]，还能有效缩短中风患者康复时间，防止肌肉萎缩和痉挛[23-24]。本研究团队长期从事电针心包经穴治疗脑缺血损伤相关研究，从抗炎、抗凋亡、促血管新生、神经递质与神经营养因子分泌、促进神经元突触发生、神经修复等多角度验证电针心包经穴对脑缺血损伤的效应机制[25-29]。基于前期研究成果，本研究从神经修复角度出发，观察电针心包经穴对MCAO大鼠脑组织Nogo-A及NgR1蛋白表达的影响，探讨其可能的作用机制，为“从心治脑”理论提供实验依据。

研究表明，大鼠急性脑缺血后，缺血脑组织Nogo-A和NgR1蛋白表达明显升高[30-31]，针刺干预在促进大鼠神经功能恢复的同时可明显降低脑组织Nogo-A 与NgR1蛋白表达[32]。而Nogo-A抗体和/或NgR1拮抗剂在降低Nogo-A和/或NgR1表达同时，还能保护缺血后脑组织，在一定程度上促进神经修复及轴突再生[33-34]。由此推测，脑缺血损伤后，Nogo-A、NgR1含量增加，二者相互作用，激活下游相关通路，从而抑制轴突再生。

脑缺血发展是一个复杂动态变化的过程，其病理损害随着时间发展而变化。而神经轴突再生需要分化完全的神经元重新接受出芽信号，激活分子生长程序，然后成长为轴突。有研究者认为，整个过程需要耗时2个月以上[35-36]。目前研究大多认为Nogo-A和NgR1表达在脑缺血后第7、14或21日达到峰值[37-38]，但尚无定论。故本实验设置多个时点观察脑缺血损伤后Nogo-A和NgR1表达变化及电针干预效应。

本研究结果显示，模型组大鼠各时点缺血侧脑组织神经细胞大量凋亡，细胞间距增大、组织结构紊乱，脑组织Nogo-A和NgR1蛋白表达升高。电针心包经穴能改善大鼠缺血侧脑组织神经细胞形态，同时下调不同时点脑组织Nogo-A和NgR1蛋白表达，且在不同程度上优于肺经组。考虑可能是电针心包经穴能改善脑的血液循环，促进大脑侧支循环建立，使缺血脑组织Nogo-A和NgR1蛋白表达降低，从而促进神经修复、改善组织形态结构，也有可能随着大鼠脑缺血时间的延长，内环境发生改变，抑制Nogo-A和NgR1蛋白表达，使神经自我再生和修复能力增强，进行发芽重塑形成新的轴突。此外，电针肺经穴也能抑制部分时点Nogo-A 和NgR1 蛋白表达，考虑肺“朝百脉，主治节”，同时有“主一身之气”的生理功能，能促进血液中浊气与清气互换，并将富含清气的血液输送到脑及全身各处[39]，具体原因还需进一步扩大实验样本量研究。本实验显示，不同检测方法和不同指标所表现的有效时间点不同，通过结果分析，7 d和14 d可能为最优干预时间点，但仍需要进一步实验验证。

综上所述，电针心包经穴能抑制MCAO模型大鼠不同时点缺血脑组织Nogo-A和NgR1蛋白表达，调节轴突发芽和再生微环境，从而保护受损的神经细胞，起到神经修复作用。