基于NF-κB信号通路探讨益气活血托毒方对自身免疫性前列腺炎小鼠的影响

张泽家，杨小琴，高庆和，陈豪特，丁家森，刘剑刚，高瞻

中国中医科学院西苑医院，北京 100091

Ⅲ型前列腺炎是一种以长期、反复骨盆区域疼痛不适，可伴有不同程度排尿症状及性功能障碍为主要临床表现的疾病，严重影响患者生活质量[1]。研究显示，免疫因素在Ⅲ型前列腺炎的发生发展过程中发挥重要作用[2]。中国中医科学院西苑医院高瞻教授基于“内痈”理论及临床经验拟定的益气活血托毒方能显著缓解Ⅲ型前列腺炎患者临床症状，降低慢性前列腺炎症状评分，减少患者前列腺液中炎症因子表达[3]，但其作用机制尚未完全明确。课题组前期研究发现，益气活血托毒方与Ⅲ型前列腺炎的交集靶点主要富集在核转录因子-κB（NF-κB）通路上，故预测益气活血托毒方可能通过降低前列腺组织炎症因子水平，阻止其下游NF-κB抑制物激酶（IKKs）磷酸化及NF-κB抑制蛋白α（IκBα）与NF-κB二聚体解离，从而抑制NF-κB进入细胞核内催化炎症因子产生和激活免疫反应。目前认为，Ⅲ型前列腺炎发病与自身免疫关系密切，自身免疫性前列腺炎（experimental autoimmune prostatitis，EAP）小鼠模型是研究Ⅲ型前列腺炎的标准动物模型之一[4]。基于此，本研究应用前列腺蛋白提纯液联合弗氏完全佐剂建立EAP小鼠模型，观察益气活血托毒方对EAP小鼠前列腺组织病理变化、炎症反应及免疫功能等方面的影响，探讨其治疗Ⅲ型前列腺炎的作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物

SPF 级8 周龄C57BL/6 雄性小鼠60 只，体质量（23±2）g，8 周龄雄性SD 大鼠10 只，体质量（180±20）g，斯贝福（北京）生物技术有限公司提供，动物生产许可证号SCXK（京）2019-0030，合格证号110324211104281256。饲养于中国中医科学院西苑医院SPF级动物房，温度（24±2）℃、湿度50%～70%环境，动物使用许可证号SYXK（京）2018-0018。本实验经中国中医科学院西苑医院伦理委员会审批（2021XLC043-2）。

1.2 药物及制备

益气活血托毒方由黄芪30 g、党参15 g、丹参15 g、川芎10 g、白术10 g、茯苓10 g、熟大黄6 g组成，由中国中医科学院西苑医院制剂室制成浸膏，每克浸膏含原药材2.5 g。盐酸坦索罗辛缓释胶囊，0.2 mg/粒，江苏恒瑞医药股份有限公司，临用前取胶囊内容物，用蒸馏水配制成0.65 μg/mL溶液。

1.3 主要试剂与仪器

弗氏完全佐剂（美国Sigma，批号SLCB9716），0.5%Triton X-100（上海碧云天生物技术有限公司，批号120320210616），BCA蛋白试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司，批号122120210520），小鼠免疫球蛋白IgG/A/M试剂盒（北京华英生物技术研究所，批号20220105BH），血清肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）试剂盒（北京欣博盛生物，批号分别为20220105X、20220106X），p-NF-κB p65、IL-1β抗体（英国Abcam 公司，批号分别为ab86299、ab283818），p-IKK-β、TNF-α抗体（美国GeneTex公司，批号分别为GTX52310、GTX110520）。

MultiSkan3 型酶标仪，美国Thermo 公司；EG1150型病理包埋机，德国Leica公司；7160型全自动生化仪，日本Hitachi公司；DR-200BS型全自动酶标分析仪，无锡华卫德朗仪器有限公司；Mini P-4型电泳槽、湿转电泳槽，北京凯元信瑞仪器有限公司；PowerPac型电泳仪，美国Bio-Rad公司。

1.4 前列腺蛋白提纯液制备

取10只大鼠，常规饲养7 d，3.5%水合氯醛腹腔注射麻醉，取前列腺，放入冰生理盐水中，去除脂肪、膀胱等组织，清洗3～5次，剪碎，加入含0.5% Triton X-100的生理盐水，冰浴匀浆，4 ℃、15 000 r/min离心30 min[4]，去除上层脂肪组织，取上清液，即得前列腺蛋白提纯液，放入冻存管，-20 ℃保存备用。临用前用BCA法测定蛋白浓度，根据蛋白浓度用0.01 mmol/L PBS将蛋白提纯液稀释至15 mg/mL。

1.5 造模

取50只小鼠，肌肉注射氯胺酮（4～6 mg/kg）麻醉，在小鼠双侧脚掌、双侧腹股沟及颈部共5处皮下注射0.1 mL前列腺蛋白提纯液与0.1 mL弗氏完全佐剂的混合液[4-5]。造模0、15、30 d 各注射1 次。造模15、22、30 d各随机选取2只小鼠，取前列腺组织进行病理检测，观察炎症进展情况。造模45 d随机选取4只小鼠，取前列腺组织进行病理检测，若见黏膜皱襞消失，腺上皮破坏，间质明显肿胀、模糊，有大量炎症细胞浸润，表明模型制备成功[4]。

1.6 分组及给药

将造模成功的40只小鼠随机分为模型组、西药组和中药低、高剂量组，每组10只。另取10只小鼠作为空白组。造模成功次日开始给药，中药低剂量组按人与小鼠等效剂量换算[6]，益气活血托毒方浸膏4.8 g/kg，高剂量组剂为9.6 g/kg，西药组予0.65 μg/mL盐酸坦索罗辛溶液灌胃，灌胃体积0.4 mL/只，模型组和空白组予等体积饮用水灌胃，每日1次，连续4周。

1.7 指标检测

1.7.1 小鼠一般状况

造模及给药期间，观察小鼠生活状态及体征，造模期间每15 d记录1次体质量，给药期间每2周记录1次体质量。

1.7.2 血清炎症因子和免疫因子检测

给药结束后，肌肉注射氯胺酮麻醉，眼球取血，4 ℃、2 500 r/min离心10 min，取血清，根据ELISA试剂盒说明书操作，酶标仪检测吸光度，根据标准曲线计算血清TNF-α、IL-1β、IgA、IgG、IgM含量。

1.7.3 前列腺组织病理观察

末次给药后24 h脱颈处死小鼠，分离前列腺组织，于10%福尔马林溶液固定72 h后石蜡包埋，组织切片，37 ℃烤片12 h，脱蜡复水，HE染色后封片，光镜下观察前列腺组织病理变化。

1.7.4 Weston blot检测蛋白表达

取前列腺组织，以组织质量∶裂解液体积=1∶9比例加入RIPA裂解液，15 000 r/min匀浆，每次10 s，间隔10 s，重复3次。冰孵20 min，4 ℃、13 000 r/min离心20 min，取上清液，BCA法测定蛋白浓度，以RIPA裂解液调整蛋白浓度，加入5×上样缓冲液，使蛋白终浓度为4 mg/mL，煮沸变性5 min。5%浓缩胶电泳，恒压90 V、20 min，12%分离胶，恒压160 V，通过预染蛋白marker确定电泳停止时间。300 mA转至NC膜。3%BSA 封闭，加入p-NF-κB p65 一抗（1∶1 000）、p-IKK-β一抗（1∶1 000）、TNF-α一抗（1∶2 000）、IL-1β一抗（1∶1 000），4 ℃孵育过夜。TBST 洗膜，加入HRP-山羊抗兔IgG（1∶10 000）孵育1 h，洗膜，ECL显影。以β-actin为内参，Total Lab Quant 11.5读取积分光密度。

1.8 统计学方法

采用GraphPad Prism 8.3.0统计软件进行数据处理和分析。计量资料用xˉ±s表示，数据符合正态分布且方差齐用方差分析，不满足正态分布或方差不齐用非参数检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 益气活血托毒方对模型小鼠一般状况的影响

模型组小鼠第1次皮下注射前列腺蛋白提纯液+弗氏完全佐剂后活力明显减弱，可见皮丘逐渐吸收。至注射后第14日，活力基本恢复，烦躁情绪明显，尿量明显增加，部分小鼠有未吸收皮丘。第2次皮下注射后活力较前明显减弱，尿量稍有减少，可见明显未吸收皮丘。西药组及中药高、低剂量组小鼠一般状况均较模型组有所改善。

与空白组比较，模型组小鼠造模15 d体质量差异无统计学意义（P＞0.05），造模30、45 d小鼠体质量明显减少（P＜0.01）。与模型组比较，中药低、高剂量组及西药组小鼠给药14 d体质量明显增加（P＜0.05，P＜0.01），中药高剂量组小鼠给药28 d体质量高于西药组和中药低剂量组。见图1。

图1 各组小鼠造模和给药期间体质量变化（±s，每组10只）

2.2 益气活血托毒方对模型小鼠血清炎症因子和免疫因子含量的影响

与空白组比较，模型组小鼠血清TNF-α、IL-1β、IgA、IgG、IgM含量明显升高（P＜0.01）；与模型组比较，中药低、高剂量组和西药组小鼠血清TNF-α、IL-1β含量明显降低（P＜0.05，P＜0.01），中药高剂量组小鼠血清IgA、IgG、IgM含量明显降低（P＜0.05，P＜0.01）。见图2、图3。

图2 各组小鼠血清TNF-α、IL-1β含量比较（±s，每组10只）

图3 各组小鼠血清IgA、IgG、IgM含量比较（±s，每组10只）

2.3 益气活血托毒方对模型小鼠前列腺组织形态的影响

与空白组比较，模型组小鼠前列腺腺体周围可见散在炎症细胞，腺体显著扩张、增大，腺腔内大量粉红色分泌物，腺上皮呈扁平状，间质水肿明显；西药组小鼠腺体周围间质散在炎症细胞浸润，腺腔中等、大小不一，腔内有分泌物，腺上皮厚薄不一、呈扁平状，黏膜皱襞结构正常，间质可见水肿；中药低剂量组小鼠腺体周围间质未见明显炎症细胞浸润，或极少量炎症细胞浸润，腺腔偏小、大小不一，腔内有少量分泌物，腺上皮偏厚，多数黏膜皱襞结构正常；中药高剂量组小鼠腺体周围间质未见明显炎症细胞浸润，或极少量炎症细胞浸润，腺腔大小均匀，腺上皮较厚，黏膜皱襞结构正常。见图4。

图4 各组小鼠前列腺组织形态（HE染色，×10）

2.4 益气活血托毒方对模型小鼠前列腺组织蛋白表达的影响

与空白组比较，模型组小鼠前列腺组织p-NF-κB p65、p-IKK-β、TNF-α、IL-1β蛋白表达明显升高（P＜0.01，P＜0.05）；与模型组比较，中药高剂量组小鼠前列腺组织p-NF-κB p65、p-IKK-β、TNF-α、IL-1β蛋白表达明显降低（P＜0.01，P＜0.05）。见图5、图6。

图5 各组小鼠前列腺组织p-NF-κB p65、p-IKK-β、TNF-α、IL-1β蛋白免疫印迹

图6 各组小鼠前列腺组织p-NF-κB p65、p-IKK-β、TNF-α、IL-1β蛋白表达比较（±s，每组10只）

3 讨论

Ⅲ型前列腺炎属中医学“精浊”“尿频”等范畴[7]，其病因主要与外感六淫、饮食不节、房劳过度、久立久坐等相关[8]。湿、热、瘀、虚贯穿本病始终，临床证型以复合型为主[9]。课题组前期观察发现，本病患者存在气虚血瘀的病机基础，应用益气活血托毒方益气活血、托毒外出，临床疗效显著[3，10]。益气活血托毒方在四君子汤基础上，以党参易人参，补脾益气；黄芪为“补气圣药”，与党参协同，益气健脾，共为君药，同时黄芪可托毒排脓，发挥“补托”之功。丹参活血化瘀生新，川芎活血行气，二者一寒一温，调和药性，共为臣药。白术、茯苓补气健脾、燥湿利水，改善排尿症状，共为佐药。熟大黄逐瘀通经、凉血解毒、引药入经，为使药。全方配伍契合Ⅲ型前列腺炎病机特点，扶正祛邪，从而起到改善和逆转前列腺炎炎性改变的作用。

前列腺组织病理观察是评价EAP模型的主要指标，本实验可见模型组小鼠前列腺腺体周围散在炎症细胞，腺体显著扩张、增大，腺腔内大量分泌物，腺上皮呈扁平状，间质水肿明显，符合模型标准[4]。经药物干预后，西药组和中药低、高剂量组均有不同程度改善，其中中药高剂量组改善最明显。与空白组比较，模型组小鼠体质量增长受到严重影响，经药物干预后，小鼠体质量增长速度回升，随给药时间延长，中药高剂量组小鼠体质量高于西药组及中药低剂量组。提示益气活血托毒方通过长疗程的治疗可改善机体内环境，发挥整体调节作用。与空白组相比，模型组小鼠血清炎症因子及免疫因子含量均升高。经药物干预后，西药组和中药低、高剂量组炎症因子及免疫因子含量均有所下降，与课题组前期临床研究[3]一致。表明单独应用益气活血托毒方能降低炎症因子水平。

NF-κB通路在前列腺炎的发病机制及炎症、免疫反应中多有涉及[11-13]。TNF-α、IL-1β是NF-κB通路的重要刺激因子[14]，IKKs在NF-κB通路活化的联级反应中起核心作用[15]，其中IKK-β是IKKs的重要组成之一[16]，p-IKK-β是IKK-β的磷酸化产物，可催化IκBα，使IκBα与NF-κB解体[15]，从而使NF-κB进入细胞核内催化炎症因子产生和激活免疫反应[17]，p-IKK-β在多种炎症反应中过表达[18-19]。NF-κB p65是NF-κB的亚基之一，p-NF-κB p65是其游离状态，p-NF-κB p65表达升高提示解体的NF-κB增多[20]。本研究发现，经益气活血托毒方干预后，模型小鼠前列腺组织p-NF-κB p65、p-IKK-β、TNF-α、IL-1β蛋白表达降低，表明益气活血托毒方改善小鼠EAP 可能与降低p-NF-κB p65、p-IKK-β、TNF-α、IL-1β蛋白表达，抑制NF-κB通路，减少磷酸化IKKs合成有关。

敦煌古方大泻肾汤（茯苓、甘草、制大黄、黄芩各10 g，赤芍、干姜各3 g）可降低EAP大鼠前列腺组织NF-κB p65表达[21]，前列消汤（滑石20 g，金钱草、板蓝根、丹参、芦根各15 g，黄柏、苍术、虎杖、神曲、厚朴各10 g，苦杏仁、甘草各6 g，细辛3 g）能降低EAP大鼠前列腺组织NF-κB p65和NF-κB p50表达[22]。2项研究NF-κB p65表达降低与本研究结果一致，但其应用药物以清热解毒为主，而益气活血托毒方组成以健脾益气为主，2种中医治法指导下均起到影响NF-κB通路、改善前列腺炎病理作用，其共性部分有待进一步研究。

综上所述，益气活血托毒方可改善EAP小鼠前列腺炎症，其机制与下调p-NF-κB p65、p-IKK-β、TNF-α、IL-1β表达，减少磷酸化IKKs的合成相关。本研究为阐述益气活血托毒方治疗Ⅲ型前列腺炎提供实验证据，今后将继续探索该方起效的主要成分及相应机制。