花姜酮对心肌细胞缺氧损伤的保护作用及机制

王云燕 高伟铿

(海南省中医院 1心功能科,海南 海口 571199;2临床内科)

心肌梗死(MI)是一种常见的缺血性急性心脏病,每年有50万人以上新发MI〔1〕。MI后可观察到多种局部改变,如心室重构、心室壁结构改变、非收缩性瘢痕组织形成等〔2〕。随着现代医学的发展,MI的预后得到了一定程度的改善,死亡率也有所降低〔3〕。然而,作为一个全球性的问题,MI仍然是世界范围内发病率和死亡率的主要原因〔4〕,迫切需要创新的MI后恢复和再生治疗药物。MI是指心肌细胞因长期缺血(缺氧和营养缺乏)引起的死亡〔5〕。心肌缺血缺氧后引起的损伤是心肌细胞不可逆损伤〔6〕。H9c2细胞是一种来源于大鼠胚胎心室肌细胞的细胞系,与原代心肌细胞有许多相似之处,研究通过在缺氧处理的H9c2细胞上进行实验,探究心肌缺血的潜在治疗方法〔7〕。又因成人心肌细胞增殖能力有限,这使诱导心肌细胞增殖为治疗MI的一种可能方案〔8〕。因此,缺氧处理后H9c2细胞增殖和凋亡的变化可作为潜在治疗药物的评价指标。花姜酮(ZER)是从亚热带姜科植物中分离得到的一种天然化合物,具有抗氧化、抗炎等多种生物活性〔9〕。ZER还具有调控血管生成的作用,是治疗癌症的抗肿瘤药物,可逆转多种癌细胞的增殖和侵袭作用〔10〕。本研究旨在探究ZER对缺氧H9c2细胞的保护作用及潜在的作用机制。

1 材料与方法

1.1材料 H9c2细胞系(CRL-1446TM)购自美国典型培养库(ATCC)。ZER购自上海沪峥有限公司〔分子式:C15H22O,分子量:218.34,纯度:高效液相色谱(HPLC)测定≥98%〕;DEME培养基、胎牛血清、胰蛋白酶均购自美国Gibco公司;CCK-8试剂盒购自日本同仁公司;二喹啉甲酸(BCA)试剂盒购自碧云天生物科技有限公司;抗体B细胞淋巴瘤/白血病-2相关X蛋白(Bax)、半胱氨酸天冬氨酸酶(caspase)-3、caspase-9、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)、磷酸化(p)-MAPK、细胞外信号调节激酶(ERK)、p-ERK均购自英国Abcam公司。细胞培养箱购自美国Thermo Fisher公司(型号:BB150-2TCS);流式细胞仪购自美国BECKMAN COULTER公司(型号:CytoFLEX SRT);酶标仪购自美国Lonza公司(型号:LONZA ELx808);凝胶成像系统购自美国Bio-Rad公司(型号:Gel Doc EZ)。

1.2细胞培养与分组 H9c2细胞于含有10%胎牛血清的DEME培养基(含有1%青霉素和链霉素)中,在37 ℃,含有95%空气和5%CO2的培养箱中培养,每2 d更换1次培养基。为刺激缺氧损伤,H9c2细胞在37 ℃,充满94%N2、5%CO2和1%O2的低氧培养箱中培养。ZER溶解于二甲基亚砜(DMSO)中,配成10 mmol/L的母液,使用DEME培养基稀释,使最终处理浓度为:0、8、16、24 μmol/L〔10〕。从缺氧处理开始时分别使用不同浓度(0、8、16、24 μmol/L)的ZER培养36 h,依次作为对照组、8、16、24 μmol/L ZER组,另设空白组不做缺氧处理。

1.3CCK-8检测细胞活力 选取对数期生长状态良好的H9c2细胞以5×103个/ml接种于96孔细胞培养板中,过夜培养后,分别给予缺氧24、36、48 h和各组细胞缺氧36 h处理,后使用10%的CCK-8溶液替代DEME培养基培养2 h后,将96孔板放入酶标仪中检测450 nm处的吸光度(A)。细胞活力=A缺氧24 h/A缺氧0 h×100%;细胞活力=A实验组/A空白组×100%。

1.4膜联蛋白(Annexin)Ⅴ-异硫氰酸荧光素(FITC)和碘化丙啶(PI)双染色法分析H9c2细胞的凋亡率 选取对数期生长状态良好的H9c2细胞以1×105个/ml接种于6孔细胞培养板中,37 ℃孵育过夜后,给予缺氧和ZER处理。离心,收集细胞,使用提前预冷的磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗,而后添加100 μl的结合缓冲液制备形成细胞悬浮液,后添加5 μl Annexin Ⅴ-FITC和PI对细胞染色,在室温避光孵育15 min后使用流式细胞仪检测染色细胞,FlowJo软件分析各组H9c2细胞凋亡百分比。

1.5Western印迹检测凋亡及MAPK/ERK信号通路相关蛋白的表达 使用添加1 mmol/L苯甲基磺酰氟(PMSF)的RIPA缓冲液提取处理后的各组H9c2细胞蛋白质,用BCA试剂盒测定蛋白质样品的蛋白浓度。添加蛋白缓冲液在高温水浴锅中煮沸15 min,使蛋白变性,随后,将变性后蛋白点胶,上样,每孔25 μl。在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)上进行分离,并通过湿转法将蛋白转移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。用5%脱脂奶粉封闭2 h后,使用PBS冲洗3次后,添加PBS稀释的抗体Bax、caspase-3、caspase-9、MAPK、p-MAPK、ERK、p-ERK低温摇床孵育过夜。隔天使用PBS冲洗PVDF膜,后添加二抗(山羊抗兔IgG-HRP)室温孵育2 h,再次使用PBS冲洗。后按照试剂盒说明添加电化学发光(ECL)混合液检测免疫反应信号,使用ImageJ软件对免疫强度(条带灰度)进行定量。目的蛋白相对表达量=目的蛋白条带灰度/内参蛋白(β-actin)条带灰度。

1.6统计学分析 实验重复均超过3次,采用SPSS25.0软件进行单因素方差分析。

2 结 果

2.1不同缺氧时间对H9c2细胞活力的影响 缺氧0、12、24、36、48 h H9c2细胞活力分别为:(100.12±2.40)%、(98.38±1.34)%、(75.12±8.79)%、(41.56±4.69)%、(26.45±3.15)%。与缺氧0 h相比,缺氧24、36和48 h的H9c2细胞存活率显著降低(F=189.753,P=0.000,n=4),而细胞活力在缺氧处理12 h内基本保持不变,但在缺氧处理36 h时细胞活力下降到一半,因此在随后的实验中将细胞置于低氧条件下孵育36 h。

2.2ZER对H9c2细胞缺氧损伤的影响 与空白组相比,其余4组细胞活力显著降低(P<0.05);与对照组相比,ZER处理组可显著提高细胞活力(P<0.05),且呈现浓度依赖性(P<0.05)。与空白组相比,其余4组H9c2细胞的凋亡率及Bax、caspase-3和caspase-9的蛋白表达显著上调(P<0.05);与对照组相比,ZER处理组可显著降低凋亡率和H9c2细胞中Bax、caspase-3和caspase-9的蛋白表达(P<0.05),且均呈现浓度依赖性(P<0.05)。说明ZER可减轻H9c2细胞的缺氧损伤。见表1、图1、图2。

图1 流式细胞仪检测ZER对缺氧H9c2细胞凋亡率的影响

1～5:空白组、对照组、8 μmol/L ZER组、16 μmol/L ZER组、24 μmol/L ZER组;图3同

表1 各组H9c2细胞活力、凋亡率及Bax、caspase-3和caspase-9蛋白相对表达量比较

2.3ZER对缺氧H9c2细胞中MAPK/ERK信号通路的影响 与空白组相比,其余4组H9c2细胞中MAPK、ERK的蛋白相对表达量无显著性差异(P>0.05),而p-MAPK、p-ERK蛋白表达显著下调(P<0.05);与对照组相比,ZER处理组可显著提高p-MAPK、p-ERK的蛋白表达(P<0.05),且呈现浓度依赖性(P<0.05),而对MAPK、ERK的蛋白表达无影响(P>0.05)。见图3、表2。

图3 Western印迹检测各组H9c2细胞中MAPK、p-MAPK、ERK、p-ERK蛋白表达

表2 各组H9c2细胞中MAPK、p-MAPK、ERK、p-ERK蛋白相对表达量

3 讨 论

MI是指心肌细胞因长时间缺血而死亡〔11〕。缺氧是MI的主要风险之一,是氧气不足以支持新陈代谢的一种状态〔12〕。在缺氧条件下,能量代谢从线粒体呼吸转变为无氧糖酵解,同时引起大量的生理和病理反应,导致酸中毒和细胞坏死〔13〕。本研究结果显示,缺氧时间可能与细胞损伤的程度呈正相关;缺氧处理后H9c2细胞增殖受到抑制同时,凋亡增强,说明H9c2细胞缺氧损伤模型构建成功。

生姜作为最古老的草药之一,因其具有抗癌作用备受关注〔14〕。几千年来,中国人一直把生姜作为治疗头痛、恶心和感冒的传统药物〔15,16〕,在西方和地中海地区,生姜因含有抗炎化合物而被用于治疗肌肉疼痛、关节炎和骨关节炎,同时其对牙龈炎症、牙痛、哮喘、脑卒中、糖尿病和便秘也具有一定的作用〔17〕。ZER是从生姜的根茎中提取的挥发油得到的,约占59%〔9〕。研究数据表明,ZER具有抑制肿瘤细胞增殖,促进凋亡的作用,具调节机体免疫等多项功能〔18〕。故对ZER研究一直是一种热点,ZER可用于治疗不同类型的癌症,如结肠癌、乳腺癌、宫颈癌和肝癌,而且与正常细胞相比,其不仅可以抑制肿瘤细胞的增殖,还可显示出对癌细胞的选择性作用〔9〕。本研究结果表明,ZER处理可通过促进H9c2细胞增殖、抑制细胞凋亡,从而减轻H9c2细胞的缺氧损伤。

在细胞缺血损伤中,多种激酶信号转导可参与调控细胞的增殖和凋亡过程,包括:PI3K/AKT、MAPK/ERK和JAK/STAT〔19〕。Yan等〔20〕研究证明,丙泊酚在心肌细胞中通过激活MAPK/ERK通路呈剂量依赖式降低心肌细胞的凋亡率,进而发挥对心脏的保护作用。Ren等〔21〕研究发现,厄贝沙坦可通过调控MAPK/ERK信号通路中ERK的基因和蛋白水平进而改善心肌病理损伤,对大鼠心脏起到保护作用。本研究发现,细胞缺氧损伤后,MAPK/ERK通路的激活可能被抑制;MAPK/ERK通路可被ZER激活,说明ZER可通过激活MAPK/ERK通路削弱细胞损伤。

综上,ZER可促进缺氧心肌细胞增殖,抑制其凋亡,且这种作用可能是通过激活MAPK/ERK信号通路实现的。但本研究并未深入探究ZER是如何通过影响MAPK/ERK信号通路表达进而对心肌细胞损伤发挥保护作用的,还需更进一步的研究。