白屈菜碱调控TGF-β1/Smad信号通路对肾癌增殖机制的影响

潘世杰 蒋俊玲 赵俊峰 周磊 王交托

(1河南中医药大学,河南 郑州 450000;2河南省中医院泌尿外科)

肾癌是肾实质内小管上皮恶变,研究指出2021年新增约7.6万例肾癌,因其死亡者约1.4万〔1〕;国内学者研究预测2025年肾癌死亡率将较2019年增加7.74%〔2〕。半数以上无症状肾癌(偶发性肾癌)确诊时已发生转移,根治性肾切除术(RN)及辅助疗法效果欠佳,其5年生存率无法超越10%〔3〕。白屈菜是白屈菜属(隶属于罂粟科植物)干燥全草的总称,经研究发现其有效成分白屈菜碱可抑制许多癌细胞增殖,如乳腺癌(MCF-7细胞)、胶质母细胞瘤及人口腔上皮样癌(KB细胞)等,且有研究证实,该中药单体也有助于逆转多重耐药(MDR)的乳癌细胞作用〔4～7〕。转化生长因子(TGF)-β1/Smad信号通路对肾癌进展有不可估量的作用,但白屈菜碱基于TGF-β1/Smad通路对肾癌的影响机制尚不明确。本实验旨在探究中药白屈菜碱调控TGF-β1/Smad信号通路干预肾癌荷瘤小鼠的机制。

1 材料与方法

1.1实验细胞及动物 小鼠肾癌细胞,购于BNCC公司;SPF级BALB/c雄性4～8周龄小鼠,体质量18～20 g,购自郑州市惠济区华兴实验动物养殖场,许可证号:SCXK(豫)2019-0002。

1.2实验试剂 白屈菜碱购于MedChemExpress公司;培养基(RPMI1640)、0.25%胰酶-乙二胺四乙酸(EDTA)、胎牛血清(FBS)和磷酸盐缓冲液(PBS)等购自以色列BI公司;二喹啉甲酸(BCA)蛋白浓度测定试剂盒,购自碧云天(Beyotime)生物技术有限公司;青-链霉素混合液(PS)、二甲基亚砜(DMSO)和RIPA裂解液及ECL显影液购自索莱宝公司;Smad3蛋白购自美国CST公司;Smad7蛋白购自Thermo Fisher公司;Bcl-2、Bax、Caspase-3及二抗均购自Rockland公司;内参蛋白GAPDH购自武汉三鹰有限公司。

1.3培养Renca细胞 取肾癌Renca细胞进行解冻及复苏,后放于完全培养基中恒温培养,达80%～90%饱和度时用胰蛋白酶消化离心,配制1×107个/ml Renca细胞悬液,置于盛有冰块的泡沫箱备用。

1.4构建肾癌荷瘤小鼠 待新购买的小鼠在IVC笼盒系统适应性生存1 w后,在每只小鼠右前肢腋窝处皮下注射0.15 ml充分混匀的肾癌Renca细胞悬液。

1.5分组及给药 种植癌细胞后,随机分为对照组(模型组)和实验组(白屈菜碱组),每组8只,观察瘤块的生长情况,种植癌细胞约2 w,观察造模成功。实验组给20 mg/kg白屈菜碱溶液灌胃;对照组按照相同剂量给生理盐水进行灌胃;给药 14 d,药物干预期间每间隔2 d用游标卡尺测量肾癌荷瘤小鼠瘤块长径和短径,电子天平测量肾癌荷瘤小鼠体质量。药物干预结束后麻醉小鼠,仔细剥离肾癌荷瘤小鼠皮下的种植瘤块,将各瘤块分两半,分别用液氮冷冻保存和4%多聚甲醛固定。抑瘤率=〔(对照组瘤块重量-实验组瘤块重量)/对照组瘤块重量〕×100%。

1.6苏木素-伊红(HE)染色观察各组肾癌荷瘤小鼠瘤块组织病理改变 (1)将肾癌荷瘤小鼠肿瘤切成合适大小放于组织包埋盒中标记;(2)将瘤块脱水→浸蜡→石蜡包埋→瘤块组织病理切片→切片摊片→烘烤组织切片→脱蜡水化、苏木素染色→分色→伊红染色→脱水透明→封片及图像采集。

1.7Western印迹法检测瘤块 TGF-β1/Smad 通路相关及增殖相关蛋白表达情况 (1)在配制好的蛋白裂解液中加入肾癌荷瘤小鼠的瘤块组织进行蛋白提取;(2)采用BCA 法进行蛋白定量;(3)十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)进行蛋白电泳;(4)将目的蛋白采用湿转法转移到硝酸纤维素膜;(5)采用浓度5%脱脂奶粉进行蛋白封闭;(6)进行封闭后的蛋白条带进行目的蛋白条带片段剪裁,将相应目的条带加入 Smad3、Smad7、Bax、Bcl-2、Caspase-3及GAPDH一抗后进行孵育,4 ℃摇床下过夜;(7)TBST洗涤目的条带后放置于二抗中进行1 h孵育二抗;(8)ECL显色;(9)采用ImageLab软件进行目的蛋白的定量分析,检测条带灰度值。

1.8统计学方法 采用SPSS24.0软件进行t检验。

2 结 果

2.1绘制肾癌荷瘤小鼠时间-体积曲线图及计算白屈菜碱的抑瘤率 建造肾癌荷瘤小鼠模型过程中,瘤块种植成功率为93.75%;在药物干预模型小鼠期间,肾癌荷瘤小鼠无死亡,即100.00%存活率,表明中药白屈菜碱给药剂量对肾癌荷瘤小鼠未发生短期或明显毒理作用,或在该剂量浓度作用下,小鼠耐受力尚可调节;白屈菜碱对肾癌荷瘤小鼠瘤块的抑瘤率为43.20%,可见中药白屈菜碱对肾癌荷瘤小鼠的瘤块增殖具有一定抑制效果。且根据白屈菜碱干预期间,各组肾癌荷瘤小鼠的肿瘤体积长势可见,在白屈菜碱对肾癌荷瘤小鼠干预第13天后,白屈菜碱组瘤块体积较对照组明显升高(P<0.05),见表1。

表1 药物不同时间两组瘤块体积比较

2.2HE染色检测两组肾癌荷瘤小鼠肿瘤组织镜下病理改变 对照组肿瘤组织周边可见有一圈肿瘤假性包膜包裹,且可见该种植瘤的瘤块组织内有坏死(干酪样)区域、呈无规则性片状分布。两组肿瘤组织中形成许多新生血管,且肿瘤细胞呈异型性,细胞核呈病理性核分裂象,见图1。

图1 两组肿瘤组织切片病理改变(HE染色)

2.3两组瘤块中TGF-β1/Smad通路相关及增殖相关蛋白表达比较 干预2 w,白屈菜碱组Smad3、Bcl-2蛋白表达较对照组显著下调,Smad7、Bax、Caspase-3蛋白表达显著上调(P<0.05),见表2、图2。

图2 两组TGF-β1/Smad通路相关及增殖相关蛋白表达

表2 两组瘤块蛋白表达比较

3 讨 论

肾癌的隐匿性发病导致其无法早诊断、早治疗,临床及实验经验可知RN对于晚期肾癌已无济于事,靶向及免疫治疗等现代医疗手段均存在免疫耐受等缺陷,约80%肾癌患者达不到治愈水平〔8〕。研究表明,一些中医药可通过调控基因或相关通路蛋白等来诱导、阻碍癌细胞的周期进展等,从而控制癌症恶化进程。中药白屈菜归肾、肺、心经,性凉、味苦、有小毒,该药对于身体疼痛能够较好缓解、对抗炎症反应及对一些癌症进展有一定抑制疗效,其主要成分包括生物碱类(白屈菜碱、小檗碱、血根碱、白屈菜红碱、黄连碱、四氢黄连碱及原阿片碱等)及非生物碱(白屈菜酸及白屈菜醇等)〔9,10〕,有助于加速尿液及水分排出、解全身毒素、止咳及全身镇痛等,在临床实践中,医生可通过用此药来治疗腹水及全身或局部水肿患者、缓解胃部疼痛感、胃溃疡及腹痛等症状。白屈菜碱是一种异喹啉生物碱,具有抗肿瘤、抗炎症等特性。Jang等〔11〕研究发现,白屈菜碱可通过GADD45a-p53诱导胰腺癌细胞的凋亡程序;Xie等〔12〕发现,白屈菜碱可调控EGFR-AMPK 通路的选择性,在一定程度上阻碍那些因为服用吉非替尼(Gefitinib)治疗而产生耐药的非小细胞肺癌(NSCLC)患者的癌细胞恶化;也有研究表明白屈菜碱可增强乐伐替尼对肝癌细胞的抗肿瘤作用〔13〕。由于肾癌发病机制目前尚不明确,有很多病因病机假说,其中,TGF-β1/Smad通路在肾癌发展中发挥多重效应,在多种癌症及炎症研究中均有对TGF-β1/Smad信号通路的探讨,该通路在癌症早期抑制癌细胞增殖侵袭,癌症后期反而促进癌细胞进一步恶化。Zhu等〔14〕发现,CD82/KAI1(一种转移抑制因子)能够通过抑制TGF-β1/Smad信号调节,在肾癌的加速恶化进程中发挥不可替代作用;Yu等〔15〕发现CD151(作为4跨膜超家族的重要成员之一,能够把整合素接受到的各种生物信号转导细胞内,是一种十分重要的细胞结构基础)通过激活TGF-β1/Smad信号促进肾癌细胞的转移;张苗等〔16〕研究发现,通过下调一种肽基-脯氨酰顺反异构酶能够抑制肾癌细胞增殖、迁移和侵袭且可在一定程度影响TGF-β1/Smad通路活化情况,这种被调节的物质便是FK506结合蛋白(FKBP)11。

TGF-β1是一种多肽蛋白,研究证实其具有高度多效性及多种生物学的功能,且作为启动TGF-β1/Smad信号通路的一个初始决定性因子,该因子异常表达时与TGF-βⅠ型和Ⅱ型受体结合并激活后可磷酸化下游受体Smad蛋白(Smad3蛋白为主),将Smad3转位至细胞核内,将上游信号从胞质转入胞核,与细胞核内的相关目的基因结合后,有效诱导发挥促癌效应,且诱导细胞外基质合成及促进上皮间质转化(EMT)等,且降低Smad3蛋白表达水平也可抑制癌细胞迁移〔17〕。Smad7是TGF-β1/Smad通路中的受体抑制型因子(I-Smad),可与活化后TGF-β Ⅰ型受体结合以阻断Smad3磷酸化,达到负反馈调节作用;另一方面,Smad7可进入细胞质与Smad3竞争性结合,拮抗 Smad3与TGF-β受体结合,从而有效阻断Smad3在TGF-β1/Smad通路中的传导作用;且Smad泛素化调节因子(Smurf)2能选择性泛素化降解掉Smad7,影响Smad7基因及蛋白表达水平进而调控癌症进展〔18〕。另有研究发现,磷酸化(p)-Smad3 会抑制Smad7的转录,而Smad7与TGF-β Ⅰ型受体结合又会抑制p-Smad2和p-Smad3的表达〔19〕。另外,促凋亡Bax及抗凋亡Bcl-2通过线粒体途径调节激活下游信号因子,诱导下游Caspase家族,在一系列效应因子共同作用下发生级联效应,进一步诱导癌细胞的凋亡程序发生。本研究结果表明白屈菜碱对肾癌荷瘤小鼠的瘤块增殖抑制作用可能是通过调控Smad3和Smad7蛋白表达水平实现的,但仍需深入研究Smad7对Smad3抑制作用及Smad3如何调控其他下游细胞因子限制肾癌恶变。

综上,中药白屈菜碱对肾癌荷瘤小鼠的瘤块增殖具有抑制作用,该机制可能与TGF-β1/Smad信号通路中因子状态相关,Smad3蛋白表达下调、Smad7蛋白表达上调,为白屈菜碱应用于临床以延长肾癌患者生存率提供研究依据。