枸杞内生真菌的筛选、鉴定及其生防作用

候彩霞,丁德东,何 静,*,赵吉桃,李彦湘,赵 倩,张崇庆,李 南

(1.甘肃农业大学 林学院,甘肃 兰州 730070; 2.甘肃省枸杞无害化栽培工程研究中心,甘肃 兰州 730070)

枸杞(Lyciumbarbarum)属茄科(Solanaceae)枸杞属(Lycium)植物,药食同源,主要分布于我国四川、内蒙古、陕西、甘肃、宁夏、青海和新疆等地[1]。枸杞富含蛋白质、氨基酸、维生素和铁、锌、磷、钙等多种人体必需的营养成分,是许多滋补、保健品的天然原料,具有促进和调节免疫功能、保肝和抗衰老的功效,备受消费者的青睐[2-4]。近年来,随着枸杞种植面积的扩大和种植年限的增加,以及化学农药的大量使用,不仅造成了土壤生态平衡的破坏,而且使得根腐病大规模发生,并有逐年加重趋势。由于不同地区地理和气候等生态条件存在差异,引起枸杞根腐病的病原菌种类和优势种也有差别,宁夏和青海枸杞种植区致病菌的优势种为镰刀菌(Fusarium),而新疆枸杞种植区的致病菌主要以疫霉(Phytophthora)和丝核菌(Rhizoctonia)为主[5-7]。甘肃各产区病原菌分离种类和频率有较大差异,靖远县以尖镰孢菌(Fusariumoxysporum)为优势种,其余采集地均以腐皮镰孢菌(Fusariumsolani)为优势种[8-9]。目前,多采用化学药剂对枸杞植株进行灌根处理,防治枸杞根腐病的发生,但由于化学农药的不规范使用,易造成农药残留[10]。因此,筛选安全高效生物菌剂、开展生物防治受到越来越多的关注。

植物内生真菌是指其生活史的某一阶段或整个阶段生活在健康的植物组织或细胞内,且不会引起宿主植物产生明显病害症状的一类真菌[11],它不仅能促进寄主植物生长[12]、增强其抗病能力[13-14],还可通过与病原菌争夺营养物质和空间、产生一些抗生素类和水解酶类等物质来抑制病原菌的生长,最终导致病原菌死亡[15]。链格孢属(Alternaria)真菌能适应多种生活方式,如植物病原体、弱兼性寄生虫、腐生菌,作为内生菌,它具有一定的生物防治潜力[16]。研究发现,Alternariasp. CGMCC 17463能够通过提高紫花苜蓿的氮、磷、钾含量来促进其生长[17]。朱海霞等[18]研究发现,极细链格孢菌HZ-1可作为防除猪殃殃、藜等阔叶杂草生物除草剂的候选菌株。部分链格孢属真菌的发酵产物具有抑菌活性和抗氧化活性,在生物防治方面有很大的应用价值[19]。刘建利[20]研究表明,枸杞内生真菌链格孢属发酵产物能够通过有效清除OH自由基(·OH)提高抗氧化能力,进而增强枸杞抗病性;赵倩等[21]研究表明,苹果内生落葵链格孢(Alternariabasellae)Al67对苹果树腐烂病菌有显著抑制作用,其培养滤液对苹果树腐烂病具有良好的田间防效。此外,陈思杰[22]研究发现,枝孢样枝孢霉(Cladosporiumcladosporioides)和A.alternata培养滤液对尖孢镰刀菌(F.oxysporum)引起的枸杞根腐病具有一定的生防效果。综上可知,内生链格孢菌通过促进寄主植物生长、产生抗生素和水解酶、诱导抗性等方式来提高植物抗病性。尽管已有链格孢属真菌有效防治多种田间病害的研究,但A.alternata作为枸杞内生真菌对枸杞根腐病主要致病菌——腐皮镰刀菌F.solani是否具有生防作用还有待揭示。

本研究采用组织分离法从健康枸杞植株分离内生真菌,通过平板对峙法筛选获得对F.solani具有抑制作用的生防菌株,根据形态特征和分子生物学鉴定明确其分类地位,并通过分析不同浓度拮抗菌细胞培养原液、滤液、失活液对F.solani生长的影响,筛选生防菌株的有效抑菌浓度,最后通过盆栽试验验证其生防效果,为枸杞根腐病的生物防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株与植物

枸杞为3年生宁杞7号健康枸杞盆栽植株。枸杞根腐病致病菌F.solani保存在甘肃农业大学森林保护实验室。

1.1.2 药剂

通用基因组DNA提取试剂盒(D2100,购自北京索莱宝科技有限公司,中国);无水乙醇(分析纯)纯度≥99%。

1.2 方法

1.2.1 内生真菌的分离纯化

内生真菌的分离参考张冬静[23]的方法并作修改。用自来水将新采集的枸杞枝、叶和根表面冲洗干净,然后将枝条和根截成3～4 cm长,叶片截成1 cm长,分别将根、枝、叶放在无菌广口瓶中,在超净工作台消毒。按以下消毒时间和消毒试剂消毒:75%乙醇浸泡30 s,无菌水冲洗3次,0.1% HgCl2漂洗15 s,无菌水冲洗3～4次,用灭菌滤纸吸干多余水分后,分别置于马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)中,每处理3次重复,25 ℃黑暗条件下培养,内生真菌长出后进行纯化,保存备用。把最后一次冲洗的灭菌水涂布在PDA平板上,置于同样条件下培养,作为空白对照,验证组织表面消毒情况。

1.2.2 拮抗菌株筛选

采用平板对峙法筛选拮抗菌株。取PDA平板上活化的F.solani菌株,用打孔器取菌饼,置于PDA平板中心,距平板边缘2.5 cm处对称接种已纯化的内生真菌单株菌株,每处理重复3次,25 ℃培养,待对照组近乎长满培养皿后,采用十字交叉法测量菌丝直径,计算菌丝生长抑制率。

RI=(dCK-dt)/dCK。

(1)

式(1)中:RI表示菌丝生长抑制率;dCK表示对照组菌落直径;dt表示处理组菌落直径。

1.2.3 拮抗菌株的鉴定

形态学鉴定:选取具有高效拮抗作用的菌株,取培养皿边缘菌饼(d=6 mm),并转接至PDA平板中央,于25 ℃培养箱中培养,每隔2 d观察菌落形态,至菌丝长满培养皿时,光学显微镜下观察其菌丝形态、产孢结构和分生孢子梗着生情况。根据观察到的形态特征参照《真菌鉴定手册》[24]等相关文献资料,初步确定其菌株分类地位。

分子生物学鉴定:使用通用基因组DNA提取试剂盒,提取待测菌株的基因组DNA,用真菌鉴定通用引物ITS1(5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’)、ITS4(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)进行PCR扩增。扩增体系(50 μL):26 μL Mix酶(包含Taq酶1 μL、DNTP 10 μL、Buffer 15 μL),19 μL H2O,2 μL模板,1.5 μL P1引物,1.5 μL P2引物。反应条件:95 ℃ 5 min;95 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min,35个循环;72 ℃ 10 min。回收目的条带并测序,在NCBI(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)中进行序列比对分析,采用MEGA软件的Neighbor-Joining 法构建系统发育树。

1.2.4 拮抗菌细胞培养原液、滤液、失活液对F.solani菌丝生长的影响

参照王德浩[25]的方法并做修改。首先将筛选获得的高效拮抗菌株50 μL(浓度为1×107CFU·mL-1)接种于75 mL 马铃薯葡萄糖(PDB)培养液中,25 ℃、160 r·min-1培养7 d,制备以下3种处理液:(1)培养原液;(2)培养液滤液,将培养原液4 500×g离心25 min,取上清液,将上清液用0.22 μm滤膜过滤获得培养液滤液;(3)失活液,将培养液滤液经121 ℃高温灭菌处理20 min,得到失活液。将上述3种处理液按照1.25%、2.5%、5%、10%、20%的比例与PDA培养基混合后制成混合平板,以PDA培养基为对照,每组处理重复3次。在混合平板中央接种F.solani菌饼,25 ℃培养7 d后,用十字交叉法测量菌落直径,计算菌丝生长抑制率,计算方法同1.2.2节。

1.2.5 培养液对F.solani孢子萌发的影响

参照Li等[26]的方法并做适当修改。将无菌培养液与已制备好的F.solani孢子悬浮液按体积分数10%、20%、30%、40%和50%混匀,以PDB培养液与F.solani孢子悬浮液的等体积混合液为对照,充分混合后,用移液枪吸取适量混合液悬滴于凹玻片上,在28 ℃保湿培养,6 h后镜检孢子萌发情况,每个处理3次重复,每次镜检150～200个孢子,分别计算孢子萌发率和孢子萌发抑制率。

Rg=n/N;

(2)

Rg,J=Rg,t/Rg,CK;

(3)

Rg,I=(Rg,CK-Rg,J)/Rg,CK。

(4)

式(2)～(4)中:Rg为孢子萌发率;n为萌发孢子数;N为调查的孢子总数;Rg,J为处理校正孢子萌发率;Rg,t为处理孢子萌发率;Rg,CK为空白对照孢子萌发率;Rg,I为孢子萌发抑制率。

1.2.6 生防效果测定

菌株培养液的生防效果测定参考陈思杰的方法[22]并作修改。挑选长势一致的枸杞盆栽苗,伤根法接种F.solani孢子悬浮液(1×106CFU·mL-1),设置5个处理,每个处理10株,共计50株枸杞苗。用50 mL YBG8培养液对枸杞根部进行灌根接种:①单接拮抗内生真菌;②单接F.solani;③接拮抗内生真菌7 d后接种F.solani;④清水对照组;⑤精甲·咯·嘧菌处理。接种后第30天,观察枸杞植株发病情况。

枸杞根腐病严重度分级标准参照文献[6]并做修改,计算病情指数和防治效果。枸杞根腐病严重度分级标准为:1级代表数值为0,分级标准为叶片绿色表面无黄化,根茎部无病斑,无腐烂;2级代表数值为0.5,分级标准为叶表面有少量黄化(约占总叶片数量1%～10%),根茎部表皮有褐变,剖开茎部褐变面积小于5%,或根须腐烂在15%以下;3级代表数值为1,分级标准为叶表面有部分黄化(约占总叶片数量11%～30%),根茎部表皮褐变腐烂或剖开茎部褐变面积在6%～30%,或根须腐烂在30%以下;4级代表数值为2,分级标准为叶表面有中量黄化(约占总叶片数量31%～50%),根茎部表皮明显褐变,茎部褐变面积在31%～50%,或根须腐烂在50%以下;5级代表数值为3,分级标准为叶表面有较多黄化(约占总叶片数量51%～70%),茎部褐变面积在51%～70%,或根部明显腐烂。6级代表数值为4,分级标准为叶表面黄化面积约占总叶片数量70%以上,茎部褐变面积大于70%,根部腐烂严重或植株枯死。根据以下公式计算生防效果。

R=nd/Nt;

(5)

Id=∑(nd,G×DG)/(Nt×Dmax);

(6)

Ep=(Id,CK-Id,t)/Id,CK。

(7)

式(5)～(7)中:R为发病率;nd为发病植株数量;Nt为调查植株数量;Id为病情指数;nd,G为各级病株数;DG为病级值;Dmax为最高病级值;Ep为相对防效;Id,CK为空白对照组病情指数;Id,t为处理组病情指数。

1.3 数据分析

用Excel 2016软件计算平均值和标准误差,用SPSS 24.0软件的Duncan氏新复极差法进行差异显著性分析(P< 0.05),采用Origin 2021软件绘图。

2 结果与分析

2.1 拮抗真菌的分离筛选

通过分离纯化得到106株内生真菌菌株。通过平板对峙培养法获得5株对F.solani具有抑制效果的菌株(图1),其中YBG8菌株抑制效果最好,抑制率为64.84%(图2)。因此,后续试验选择YBG8菌株。

图1 五株内生真菌对F. solani的抑制作用

数据为平均值±标准误,柱上无相同小写字母表示差异显著(P<0.05)。

2.2 拮抗菌株的鉴定

2.2.1 形态学鉴定

YBG8菌株的菌落在PDA平板上呈圆形,等径生长,初为乳白色,3～4 d后变为浅灰色,菌丝疏松,气生菌丝旺盛,絮状,背面灰色,培养5 d菌落直径达到42.80 mm。分生孢子卵形、椭圆形,黄褐色,具一个或多个明显的分生孢子痕,有时被短的次生分生孢子体分开,孢子呈倒梨形卵球形或椭圆形,具短圆柱形喙,具有0～4横向隔,隔处缩窄(图3)。参照《真菌鉴定手册》[24],结合内生真菌YBG8的生长特点和孢子形态,初步确定内生真菌YBG8菌株属于链格孢属。

A,培养3 d YBG8菌落形态正面;B,培养3 d YBG8菌落形态背面;C,培养7 d YBG8菌落形态正面;D,培养7 d YBG8菌落形态背面;E、F分别为YBG8菌丝和孢子形态。

2.2.2 分子生物学鉴定

在NCBI进行Blast同源序列分析发现,菌株YBG8与链格孢菌构成一个分支,与Alternariaalternata序列同源性最高,为100%。用MEGA7.0软件进行多序列比对,用NJ法构建rDNA-ITS序列的系统进化树(图4),发现菌株YBG8和AlternariaalternataCBS 916.96、AlternariaalternataCBS 918.96在同一分支上。综合形态和rDNA-ITS序列,最终鉴定YBG8为链格孢菌(Alternariaalternata)。

图4 YBG8与其他菌株基于rDNA-ITS序列的系统发育树

2.3 拮抗菌培养原液、滤液、失活液对F. solani菌丝生长的影响

YBG8菌株培养原液、滤液、失活液对F.solani菌丝生长的影响差异较大(表1)。其中,体积分数为20%的YBG8培养原液对F.solani菌丝抑制效果最好,培养7 d后对F.solani菌丝抑制率为70.49%;培养滤液对F.solani菌丝的抑制效果不及培养原液,但抑制效果也随着培养滤液体积分数的增大而增大;20%高温灭活液对F.solani菌丝的抑制率仅为0.10%。上述结果表明,YBG8培养原液的抑菌效果最好,滤液有一定的抑菌作用,高温灭活液无抑菌作用,且前两者对F.solani菌丝生长抑制效果具有浓度依赖性。

表1 YBG8菌株培养原液、滤液和失活液对F. solani菌丝的抑制率

2.4 拮抗菌培养滤液对F. solani孢子萌发的影响

不同浓度YBG8培养滤液处理的F.solani孢子萌发抑制率存在显著差异(P<0.05)。孢子萌发抑制率随YBG8菌株培养液体积分数的增加而增大,处理6 h,YBG8培养滤液体积分数为10%、20%、30%、40%、50%时,对F.solani孢子萌发的抑制率分别为22.17%、45.90%、47.74%、74.40%、82.4%(图5)。

图5 菌株YBG8培养滤液对F. solani孢子萌发的影响

A,F. solani;B,对照;C,YBG8;D,接种YBG8菌株 7 d后接种F. solani。

2.5 拮抗菌培养液的防病效果

接种YBG8菌株可有效降低枸杞的病情指数,对枸杞根腐病具有一定的防治效果(图6)。处理30 d后,各处理枸杞发病率见表2。精甲·咯·嘧菌处理的发病率最低,为20%,相对防效为66.7%;接种F.solani的处理发病率最高,为70%,病情指数为60%;接种YBG8菌株7 d后再接种F.solani,枸杞发病率为30%,病情指数为30%,相对防效达到50%,与对照相比,病情指数明显下降,表明YBG8菌株对枸杞根腐病具有一定的防治效果(表2)。

表2 菌株YBG8培养液对枸杞根腐病的防治效果

3 讨论

徐全智等[27]研究表明,链格孢属为枸杞内生真菌的优势属,占分离菌数的46%。链格孢属真菌主要分布于植物的茎和叶中[28-29],其他研究者在沙棘、绒毛草等植物的根部也分离到链格孢属内生真菌[30-31]。与前人研究相似,本研究也从枸杞根部分离到链格孢属真菌,这可能与这些植物根部存在适合链格孢属真菌生长和繁殖的营养成分、组织结构及其他微环境有关。

内生真菌A.alternata与F.solani之间有明显的抑菌带形成,可能是A.alternata在生长过程中产生抗生素等相关的代谢产物,从而在对峙培养中产生抑菌带。A.alternata原液抑菌效果最好,其次为滤液,失活液无明显作用。由于A.alternata原液中存在大量的A.alternata孢子,能够迅速生长繁殖,快速消耗环境中的营养物质,可能导致病原菌所需营养物质的供应减少。据报道,A.alternata可通过干扰细胞周期来抑制细胞增殖[32]。此外,培养液中含有的二苯并-α-吡喃酮类似物、环二肽类化合物对微生物具有潜在的生物活性[33-34],可抑制病原菌菌丝生长和孢子萌发。周兵等[35]从链格孢菌培养滤液分离纯化得到链格孢菌毒素细交链孢菌酮酸,其对空心莲子草具有较强的致病性。原液用0.22 μm微孔滤膜过滤后得到的滤液,仍可在一定程度上抑制病原菌的生长,这可能与滤液中还残存某些发酵活性物质有关。A.alternata失活液没有显著抑菌作用的原因可能是高压蒸汽灭菌20 min导致活性物质挥发或者失活。

许多真菌可能引起内生或致病性感染,具体取决于宿主身份、宿主条件和非生物因素[36-39]。内生真菌是等待理想条件出现的病原体或腐生菌[40-41],内生真菌的浓度对盆栽试验可能也有一定的影响。Riesen等[42]认为,Alternariaspp.演变成内生真菌可以抵抗不良环境条件对自身宿主的胁迫。这可能是单接种A.alternata比接种A.alternata后再接种F.solani的发病率高的原因。本研究中,CK和接种YBG8菌株的枸杞根腐病发病率分别为50%、40%,这可能是因为6—7月份为枸杞根腐病的高发期,而在高温高湿的环境条件下,枸杞在试验期间自然感病;接种YBG8菌株后枸杞根腐病发病率低于对照,说明YBG8菌株对F.solani有拮抗作用。链格孢菌产生的次级代谢产物——毒素,是一种对植物有毒害的非酶类小分子化合物,可以在非常低的浓度范围内干扰植物正常生理功能[43],且造成被侵染植物组织的病理反应和伤害,链格孢菌毒素能破坏质膜、叶绿体,以及线粒体的结构,从而影响细胞正常代谢[44],这可能是单接种YBG8菌株枸杞的发病率高于先接种YBG8菌株再接种F.solani的原因。与对照相比,接种YBG8菌株7 d后再接种F.solani,枸杞根腐病的病情指数显著降低,表明YBG8菌株对枸杞根腐病具有一定的防治效果,这与陈思杰[22]的研究结果一致。其可能原因诸多,一是链格孢菌通过与病原菌竞争植物光合产物,占据生态位,从而在一定程度上抑制病原菌对植物的侵害[45];二是产生代谢抑菌物质,对病原菌形成抑制作用[46];三是引发植物的防御性反应,诱导植物产生系统抗性[47]。综上,A.alternata具有良好的研发和应用潜力。

4 结论

从枸杞植株中共分离得到106株内生真菌菌株,通过平板对峙培养法筛选获得5株对F.solani具有抑制效果的生防菌株,其中从根部分离的YBG8菌株抑制效果最好,经鉴定为链格孢菌。YBG8菌株对F.solani菌丝生长和孢子萌发均有显著影响,当YBG8菌株体积分数为20%时菌丝生长抑制率为70.49%,浓度越高抑制效果越好。当YBG8菌株培养滤液体积分数为50%时孢子萌发抑制率最大,为82.4%;盆栽试验结果表明,接种YBG8菌株7 d后再接种F.solani,能显著降低枸杞根腐病的发病率。后续试验将对该菌株培养液的抑菌活性成分进行分离鉴定,明确其抑菌机制,为枸杞根腐病的生物防治奠定基础。