Keap1/Nrf2/ARE信号通路调控脑出血后氧化应激的研究进展

卢苇 尤红 张敏

脑出血是神经外科常见疾病之一,起病急,具有高致死率和高致残率的特点,30 d死亡率高达50%,仅有2%的患者在6个月后能恢复生活自理能力,给社会和家庭带来沉重负担[1]。脑出血的原因主要系非创伤性脑实质内血管发生破裂,导致脑实质内血液聚集,引起一系列神经功能缺损,常见出血部位为基底节、小脑、脑干等部位。氧化应激可导致脑出血后严重的继发性损伤,诱导大量自由基的产生并促使脑水肿的发生及脂质过氧化,损害机体神经功能。抑制氧化应激可以减轻这种损害[2]。Keap1/Nrf2/ARE信号通路是主要的抗氧化应激通路,激活该通路可促进机体抗氧化应激酶的表达,利于清除自由基,从而对机体产生保护作用。现就Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1(Kelch-like ECH-associated protein 1,Keap1)/核因子红系2相关因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2)/抗氧化反应元件(ARE)信号通路调控脑出血后氧化应激相关研究进展进行综述,以期为其临床研究提供参考。

1 脑出血后继发性脑损伤机制

除脑出血后的肿块效应引起脑组织原发性损伤外,脑出血引起的氧化应激等还可引起继发性脑损伤[3]。脑出血最常见的病因是高血压,长期高血压导致血管壁发生玻璃样变性,血管痉挛后破裂出血,随后发生氧化应激、小胶质细胞激活、红细胞溶解并释放细胞毒性物质、兴奋性谷氨酸毒性、线粒体功能障碍及炎症反应等导致自由基大量产生[4]。同时,人体存在抗氧化系统,当自由基大量生成超过机体抗氧化能力时,将启动Keap1/Nrf2/ARE抗氧化应激信号通路,并激活其下游抗氧化酶的表达,以减少自由基的产生,减轻出血后继发性损伤。继发性脑损伤将通过以下多种机制促使神经元凋亡及坏死,引起神经功能严重障碍。

1.1 氧化应激氧化应激可引起神经元大量坏死,其原因主要为自由基的产生超过抗氧化防御系统的清除能力[5],即活性氧(ROS)和活性氮产生过多。ROS是由氧自由基和非自由基氧化剂组成的分子[6],在生理条件下受抗氧化体系的调节并保持在低水平。ROS既可以通过调节激酶、磷酸酶、氧化还原酶敏感转录因子等参与细胞信号通路,以调节细胞生长、分化、增殖和凋亡,又可通过调节免疫系统杀死病原体而维持机体正常活动[7];另外ROS还可增加机体抗氧化能力和细胞信号转导[8]。脑出血后,ROS释放进一步增多,过量的ROS超过机体抗氧化防御系统的能力时,不但可直接氧化脂质、蛋白质和DNA并参与细胞死亡信号通路而损伤细胞[9],还可破坏血脑屏障、引起神经元凋亡和神经炎症等,对大脑产生损伤。活性氮是另一种重要的自由基,主要由一氧化氮(NO)及其衍生物组成[6],NO由NO合酶在神经元、内皮细胞和活化的星形胶质细胞中产生。在生理条件下,NO介导神经传递,调节神经元的生存、增殖和分化。但在病理条件下,NO常引起毛细血管通透性改变、血脑屏障功能障碍,进而促使神经细胞损伤,过量的NO可通过多种机制导致氧化应激,另外,NO与过氧亚硝基阴离子发生反应可引起蛋白质中酪氨酸残基的氧化和硝化[3]。脑组织易发生氧化应激损伤,其原因为脑组织富含脂类和铁,相对缺乏抗氧化剂[10],如Nrf2、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH)、血红素加氧酶1(HO-1)等。研究表明,脑出血后大脑中的ROS水平随着抗氧化酶的减少而增加[11],提示抗氧化应激可改善脑出血后神经功能缺损症状,减轻炎症反应并降低脂质过氧化。

1.2 小胶质细胞激活小胶质细胞是脑内广泛分布的固有免疫细胞,可促进血肿吸收并诱导神经和血管生成,主要维持中枢神经系统的细胞稳态并识别炎症刺激的应激信号[12]。小胶质细胞包括两种亚型,即促炎型(M1型)和抗炎型(M2型)。脑出血后在凝血酶等的刺激下,M1型小胶质细胞过度活化[13],使超氧化物高表达并生成还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶,进而释放大量的ROS和活性氮,诱导氧化应激和线粒体功能障碍[14],导致肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素1β(IL-1β)等多种促炎细胞毒性因子产生,导致神经毒性诱导的神经功能缺损。

1.3 红细胞释放细胞毒性物质脑出血后,红细胞降解产物血红蛋白、血红素、胆红素等在周围实质中积累[15],血红蛋白是引起氧化应激损伤的主要调节物,而血红蛋白氧化损伤的主要途径是促使自由基的产生[10]。血红素作为一种亲脂性物质,通过脂蛋白受体相关蛋白运输到细胞内,细胞内的氯化血红素(hemin)被降解成Fe2+、胆红素和一氧化碳,Fe2+通过芬顿反应生成羟基自由基,造成ROS含量明显增加[16],破坏生物膜的稳定性,降低细胞对氧化损伤的耐受性,进而导致血管内皮细胞发生氧化性死亡;此外,血红素还具有促炎作用。胆红素浓度升高时可导致神经毒性。

1.4 兴奋性氨基酸毒性脑出血后,谷氨酸生成增多,过多的谷氨酸聚集将激活脑内N-甲基-D-天冬氨酸受体[17],促进Ca2+内流和细胞内Ca2+超载,Ca2+内流可激活神经元NO合酶促使NO生成,Ca2+超载可激活烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(NOXs)促进超氧化物的生成[18],且NO与超氧化物聚合可形成过氧亚硝酸盐,均会对DNA产生损伤。

1.5 炎症反应脑出血后氧化应激诱导的组织损伤还可触发炎症反应并释放炎症介质,炎症介质又可直接诱导氧化应激。氧化应激可激活氧化还原敏感的转录因子,如激活蛋白1和核因子kappaB(NF-κB)[19],并将炎症细胞召集到损伤部位,导致促炎因子大量释放,如NADPH氧化酶等。有研究证实,Nrf2相关信号通路可以下调NF-κB使小胶质细胞向抗炎表型转化[20]。

1.6 线粒体功能障碍线粒体主要负责能量代谢并调节氧化还原状态。脑出血后,线粒体内膜阴离子通道(IMAC)打开并伴随通透性过渡孔(MPTP)的开放[21],导致氧化环境的改变,并触发ROS的释放,高水平的ROS结合持续激活的线粒体通透性过渡孔,导致ROS爆发[22],加剧线粒体损伤,形成严重的恶性循环,另外还可使ATP生成减少[23],引起神经元损伤及机体稳态失调,导致严重的神经功能障碍。

综上所述,脑出血后ROS增多超过机体抗氧化能力由多种原因引起,ROS增多时不仅会引起氧化应激损伤,还会激活ATM/ATR-p53通路,导致细胞衰老或细胞死亡;此外,还可激活凋亡信号调节激酶1(ASK1)-p38/c-Jun N端激酶(JNK)通路[24],导致细胞死亡,对神经细胞造成严重损害。因此,减少ROS的生成是降低出血后氧化应激并保护神经细胞的一种重要方法。

2 Keap1/Nrf2/ARE通路作用机制

脑出血后,大脑中的ROS水平随着抗氧化酶的减少而增加[11],而抗氧化应激可改善脑出血后神经功能并降低炎症反应。Keap1/Nrf2/ARE信号通路对中枢神经系统具有重要的调控作用[25],通过调节细胞防御酶对抗氧化应激和/或亲电应激[26],是重要的抗氧化应激通路。

2.1 Keap1-Nrf2-ARE概况1999年Itoh等通过酵母双杂交技术筛选分离出一种新的富硫蛋白和Nrf2的负调控因子[27],并将其命名为Keap1。Keap1至少含有27个半胱氨酸残基,且具有不同的反应性水平,是Nrf2的氧化应激传感器和负调控因子[28]。Nrf2是一种具有亮氨酸拉链结构域的转录因子[29],是内源性抗氧化防御系统的主要调节剂,主要通过转移到细胞核并介导细胞保护基因的表达而发挥作用,这些基因在其启动子区域中携带一种被称为ARE的特定序列。在生理状态下,Nrf2在细胞质中被锚定在Keap1上,与Keap1偶联形成二聚体,Nrf2/Keap1二聚体与泛素连接酶Clu3形成复合物,介导Nrf2泛素化蛋白酶途径降解,使胞内Nrf2呈低水平负调控状态[30]。Keap1可将Nrf2隔离并阻止其转录活性[31],并通过Keap1的BTB(Broad complex,Tramtrack和Bric-à-Brac)结构域被泛素蛋白酶体系统快速降解致Nrf2泛素化[32]。

2.2 Keap1/Nrf2/ARE信号通路抗氧化应激机制当发生氧化应激时,Keap1作为氧化还原敏感的开关,被ROS和活性氮等修饰半胱氨酸残基并使其构象发生改变[33],抑制Nrf2泛素化、促进磷酸化可使Nrf2-Keap1二聚体解偶联后促使Nrf2进入细胞核,Nrf2稳定增加并与ARE结合,启动下游醌NADH脱氢酶(NQO-1)、HO-1等抗氧化应激基因的转录[34],进而调节抗氧化酶(过氧化氢酶等)和炎症损伤蛋白的表达[35],发挥清除ROS和活性氮、抑制炎症和氧化应激反应的作用。

2.3 脑出血后Keap1/Nrf2/ARE信号通路作用机制脑出血后,机体通过氧化应激、小胶质细胞激活、红细胞释放细胞毒性物质等途径产生大量自由基,随后激活Keap1/Nrf2/ARE信号通路,Nrf2作为氧化反应途径的守护者,可以保护细胞免受氧化应激介导的细胞死亡[36],该信号通路在保护大脑免受出血引起的氧化损伤中发挥重要作用[37]。有研究结果显示,虎杖苷、白藜芦醇均可通过调节Nrf2/ARE通路和下游基因表达,减少氧化应激反应,在大鼠脑出血模型中发挥神经保护作用[38]。葛花、枳椇子及其配伍组合通过调控Keap1/Nrf2/ARE信号通路,在急性酒精性肝损伤小鼠中发挥抗氧化应激作用[39]。另外,鞣花酸可抑制Keap1导致Nrf2在细胞核内积聚,以减少氧化应激对帕金森病患者神经元细胞的影响[40]。因此,Keap1/Nrf2/ARE信号通路作为最重要的抗氧化应激通路,被激活后可对抗氧化应激,改善神经功能。

综上所述,脑出血后继发性损伤是一个复杂的过程,氧化应激在此过程中起重要作用。Keap1/Nrf2/ARE信号通路是体内最重要的抗氧化应激通路,Nrf2可调节机体自由基的平衡及炎症反应,并保护炎症损伤后的细胞和组织,在调节脑出血后氧化应激损伤方面发挥非常重要的作用。脑出血后自由基释放增多,激活Keap1/Nrf2/ARE信号通路后,可启动下游抗氧化基因的转录,调节抗氧化酶的表达,促进自由基的清除,以抵抗氧化应激损伤。因此,Keap1/Nrf2/ARE信号通路可作为治疗脑出血后降低氧化应激并发挥神经保护作用的方法;此外,Nrf2作为一个靶点,可能为改善脑出血后神经功能障碍提供新的治疗方向。