红酒软木塞中愈创木酚残留量的不确定度评定

刘继辉，汤丽华，高琳

宁夏食品检测研究院国家市场监管重点实验室（枸杞和葡萄酒质量安全）（宁夏 750001）

愈创木酚（Guaiacol），是葡萄酒中常见的污染物之一，是一种具有“烟熏味”和“药味”物质，其感官阈值很低，据报道软木塞中的愈创木酚主要是微生物污染后的代谢产物，大部分由细菌对软木塞中香草酸的降解而产生[1]。软木塞受到极低含量的愈创木酚污染就会对葡萄酒的口感风味造成影响，并且愈创木酚会对人体皮肤和粘膜造成伤害。所以检测葡萄酒软木塞中的愈创木酚含量的工作尤为重要。目前，关于葡萄酒的研究多集中在品种培育精选、成分分析、滋气味等方面，而对葡萄酒产品中愈创木酚等污染物检测的研究较少[2]。该方法采用顶空固相微萃取法结合气相色谱质谱法测定愈创木酚，具有仪器设备灵敏度高、实验数据稳定精确的优势，对葡萄酒中愈创木酚污染物的研究测定提供了可靠保障。此次通过现在较为先进的顶空固相微萃取方法结合气相色谱质谱仪同时对葡萄酒中愈创木酚残留量进行检测，采用内标法定量以及数据收集整理，通过比较很大程度上可以分析出顶空固相微萃取法结合气相色谱-串联质谱法测定对软木塞中愈创木酚残留量做出更精确的分析。

测量不确定度是用来评定实验数据准确度，测量结果与其不确定度密切相关，不确定度越小，测量结果的质量越高[3]。目前，整个食品检测行业对于葡萄酒软木塞中愈创木酚残留量的不确定度评定研究较欠缺，亟需大量可靠稳定的数据来支持食品行业关于葡萄酒中污染物残留量的检测技术研究。此次研究采用顶空固相微萃取法结合气相色谱-串联质谱法对葡萄酒软木塞中愈创木酚残留的含量进行测定[4]。依据JJF 10591.1—2012《测量不确定度评定与表示》[5]为原则指引，然后通过建立合理的不确定度数学计算模型，对葡萄酒软木塞中愈创木酚含量测定的不确定度分量进行分步评估，从而全面的达到对软木塞中愈创木酚不确定度进行综合评定。此次不确定度的评定为葡萄酒中愈创木酚含量的测定的准确度判定提供了准确可靠的数据保障[6]。

1 材料方法

1.1 仪器及试剂材料

Aglient7890B7000C气相色谱-串联质谱仪（美国安捷伦公司）；梅特勒MS105DU电子天平（梅特勒托利多科技有限公司）；Supelco57300-U固相微萃取装置（美国西格玛奥德里奇有限公司）；IKA MS-3 basic涡旋混匀器（德国IKA公司）；HWCL-5恒温磁力搅拌水浴锅（郑州长城科工贸有限公司）。

愈创木酚标准物质（纯度≥99%，德国Dr.E公司）；无水乙醇（色谱级，美国Thermo Fisher公司）；固相微萃取头（美国西格玛奥德里奇有限公司）。样品为市售葡萄酒中软木塞。

1.2 检测方法

1.2.1 标准溶液的配制

准确称取0.101 02 g愈创木酚标准物质于100 mL容量瓶中，用12%无水乙醇定容至刻度得到1.0 mg/L的愈创木酚标准储备液，冷藏保存。用12%无水乙醇溶液将标准储备液逐级稀释，配制成愈创木酚质量浓度分别为25，50，100，250，500和1 000 ng/的标准系列工作液。

1.2.2 样品前处理

①试样制备。将待测软木塞加工成小颗粒状混匀后加封并标明标记，待测。

②提取。准确称取2.0 g（精确至0.001 g）待测的软木塞样品于250 mL三角瓶中，加入30 mL 12%无水乙醇溶液，摇床振荡15 min，常温密封浸泡24 h。将待测葡萄酒按10.0 mL每份转移至顶空瓶中，加入3.0 g氯化钠并加入磁子，密封后并振摇10 min。将样品瓶放在恒温磁力搅拌器中，在40 ℃水浴锅中不断搅拌，使用固相微萃取装置在顶空瓶中萃取30 min然后上机测定。

1.2.3 气相色谱-串联质谱条件

（1）气相色谱条件。安捷伦HP-5MS（30 mm×0.25 mm，0.25 μm）色谱柱；进样口温度：260 ℃；进样方式：不分流；流速：1.0 mL/min；气相色谱升温条件见表1。

表1 气相色谱程序升温条件

（2）质谱条件。离子源：EI源；扫描方式：正模式；检测方式：SIM扫描类型；离子源温度：230℃；运行时间：30 min。

2 测定结果分析结论

2.1 测量数学计算模型的建立

葡萄酒软木塞中愈创木酚残的含量按式（1）计算从而建立数学模型。

式中：X为葡萄酒软木塞中愈创木酚残留量含量，μg/kg；C为测定愈创木酚残留量测定的质量浓度，ng/L；V1为测定液定容体积，mL；V2为测定试样体积，mL；m为试样质量，g；frec为回收率。

2.2 标准不确定度的来源

由3.1提供的测定数学模型得出，葡萄酒软木塞中愈创木酚残留量测量结果的不确定度来源由以下方面引入，见图1。

图1 愈创木酚含量测定的不确定度来源因果图

2.3 不确定度的评定

2.3.1 标准品的相对不确定度

2.3.1.1 标准品及天平称量标品引入的相对不确定度由愈创木酚标物证书得到该标准品相对扩展不确定度为±2.0%，k=2，该不确定度按照B类评定，则对应的愈创木酚标准品的标准不确定度为0.01[3]。同时按照JJG 1036—2008《电子天平检定规程》[7]要求，此天平在实验称量范围的允许误差为0.5e（e=0.1 mg），则愈创木酚标准品的标准不确定度为，愈创木酚标准品的相对不确定度为。则愈创木酚标准品纯度和电子天平称量的产生的相对标准不确定度为。

2.3.1.2 标准溶液稀释引入的相对不确定度

准确称取0.101 02 g愈创木酚标准品于100 mL容量瓶中，用12%无水乙醇定容至刻度摇匀，配制成质量浓度为1.0 mg/L标准储备溶液。再用12%无水乙醇溶液逐级将愈创木酚标准储备溶液稀释配制成质量浓度为25，50，100，250，500和1 000 ng/L的标准系列使用液。配制愈创木酚标准工作液的过程中使用的玻璃量具及移液器，均按照按照JJG 196—2006《常用玻璃量具检定规程》和JJ G646—2006《移液器检定规程》[8]的要求，对应的不确定度按照三角分布处理，，由此评估标准溶液配制过程中玻璃量具及移液器引入的相对不确定度分量，见表2。则标准溶液稀释过程引入的相对标准不确定度为Urel(C)=。

表2 标准溶液配制过程中引入的不确定度

2.3.1.3 温度引入的相对不确定度

实验室温度变化带来的不确定度通过温度变化和水的体积膨胀系数来计算。容量瓶在20 ℃的条件下校正受温度变化影响很小可忽略不计，只考虑液体体积变化所带来的不确定度[9]。实验现场温度在20 ℃左右，所以按照此温度标准校正玻璃器皿，则水的体积膨胀系数按2.1×10-3℃进行计算，假设属于均匀分布，k=3，则由实验室温度变化引入的相对标准不确定度为。

由上述不确定度分量，得到愈创木酚标准品引入的合成不确定度：。

2.3.2 标准曲线线性拟合引入的相对不确定度

该方法用气相色谱-串联质谱仪针对6个不同浓度的愈创木酚标准工作液进行测定，且每个浓度进行3次测定。通过测定得到的数据进行最小二乘法拟合，得到相对应的数据结果，详见表3。标准曲线直线方程为Y=5 387.99X-132 959.92，其标准曲线线性相关系数r2=0.999 3。

表3 愈创木酚标准溶液峰面积

试验通过对葡萄酒待侧样品进行10次平行测定，测定结果见表4。根据标准曲线求得待测样品的平均质量浓度X0=205.4 ng/mL，则由X0的引入标准不确定度：

表4 葡萄酒软木塞中愈创木酚测量结果

式中：s(y)为标准溶液峰面积的残差的标准，s(y)=，a为愈创木酚标准溶液的曲线斜率，a=5 387.99；b为愈创木酚标准溶液的曲线截距，b=-132 959.92；X为愈创木酚标准溶液的平均浓度，=320.83；SCC为愈创木酚标准溶液质量浓度残差的平方和，=6 8944.76；p为待测样品X0的测量次数，p=10；n为愈创木酚标准溶液的测量次数，n=18。通过以上愈创木酚标准曲线线性拟合方面不确定度的评定，得到线性拟合产生的相对不确定度：。

2.3.3 样品制备称量引入的相对不确定度

样品制备称量过程中不确定度主要由所用电子天平最大允差引入[11]。按照JJG 1036—2008《电子天平检定规程》规定，此次所用电子天平对应的允许误差为±0.5 e（e=1.0 mg），按照均匀分布进行不确定度进行评估，即得到2次称量（空瓶和样品）天平引入的不确定度：=0.000 200。则对应样品制备称量过程产生的相对不确定度：Urel(pre)=Urel(m)=0.000 2。

2.3.4 测量重复性引入的相对不确定度

按照检测方法要求以12%无水乙醇为空白样品，准确吸取10份空白样品，同时向10份空白样品中加入同一浓度愈创木酚标准溶液进行加标回收重复性测定，10次测定待测样品中愈创木酚加标回收含量的数据见表4[3,11]。则通过数据得到该浓度样品算数平均值：=680.10；单次测量的标准偏差为U(Yi)==17.424；算术平均值的不确定度：=7.113。则测量此方法重复性的相对合成不确定度为=0.010 4。

2.4 合成标准不确定度

式中：Urel(sta)为标准品引入的合成不确定度；Urel(pre)为标准曲线拟合引入的相对不确定度；Urel(X0)为样品制备过程引入的相对不确定度；Urel(Y)为测量样品加标回收重复性的相对不确定度[4]。通过以上分步评估得出葡萄酒软木塞中愈创木酚的不确定度分量，结果见表5。相对应的合成标准不确定度为UC(X)=Y=。

表5 葡萄酒软木塞中愈创木酚不确定度评定及测量结果

2.5 合成扩展不确定度及测量结果

该方法采用顶空固相微萃取法结合气相色谱-串联质谱法对样品中愈创木酚残留量进行测定，假设置信概率P=95%，扩展因子取k=2，扩展不确定度计算公式：U(Y)=kUC(Y)=2×0.079=0.158 μg/kg[12]。则相对应的葡萄酒软木塞中愈创木酚的含量和扩展不确定度为X=（680±0.158）μg/kg，取包含因子k=2。

3 讨论

通过建立合适的数学模型，采用顶空固相微萃取法结合气相色谱-串联质谱法进行测定，然后通过数据结果对本试验不确定度来源进行分步分析，从而得出软木塞中愈创木酚的综合扩展不确定度0.158 μg/kg，取包含因子k=2。通过对比样品制备、标准物质、容量器具、电子天平、标准曲线拟合、样品回收率重复性等方面对不确定度评定引入的影响，可以得出此次研究中样品制备、容量器具及电子天平对不确定度影响较小，但标准物质、曲线拟合、测量重复性对不确定度的影响相对较大[3]。因此，在以后的试验操作中需注意操作细节以及提高标准物质的纯度，同时可以通过优化曲线配制过程和增加加标回收重复性测定次数的方法减少不确定度的引入，从而提高检测数据准确性[13]。

4 结论

综合以上关于采用顶空固相微萃取法结合气相色谱-串联质谱法对软木塞中愈创木酚污染物进行测定以及各不确定度来源的分析，可以得出顶空固相微萃取法结合气相色谱-串联质谱法的检测误差主要受标准物质、曲线拟合、测量重复性的影响相对较大。因此，实验员在实验操作中需注意操作细节，提高标准物质的纯度及保证实验器具、实验环境、仪器设备在同等条件下进行实验检测的方式方可减少实验误差的引入，从而提高实验数据质量。