超声辅助提取玄米茶多酚工艺的优化及其抗氧化活性研究

马艳，姜亦超，董格格，刘新宇，费鹏*，陈梦

1. 南阳理工学院张仲景国医国药学院（南阳 473000）；2. 佳木斯市向阳区市场监管综合行政执法大队（佳木斯 154002）

玄米茶是以大米为基础，经浸泡、蒸熟、加入茶叶滚炒等步骤制作而成的产品，既有淡淡的绿茶香味，又有烘炒大米的香气[1]。玄米茶含有丰富的蛋白质，还含有人体所需的维生素、矿物质等多种微量元素，因此深受消费者的喜爱[2]。同时，玄米茶具有多种生理功能，包括缓解压力、降低血糖、减肥、缓解便秘、暖胃健脾，对改善人体的消化系统有很大帮助，同时研究表明玄米茶的上述生理功能与玄米茶中所含的多酚物质密切相关[3]。多酚物质能够有效清除人体自由基、延缓衰老，是天然的抗氧化剂[4]，对其进行提取可以更好地发挥玄米茶的功效。传统提取多酚的方法有机械搅拌固液萃取与索氏萃取[5-6]，但这2种方法萃取时间过长，提取物质可能在萃取中发生化学反应，而超声波辅助萃取和微波辅助萃取可以避开这些缺点，提取多酚更高效且杂质少[7-9]。

试验以玄米茶为原料，采用单因素试验和响应面法优化玄米茶多酚提取工艺，并对其抗氧化性进行研究。选择乙醇体积分数、料液比、超声时间、超声功率4个处理参数作为变量进行试验，在单因素试验基础上，采用响应面法确定超声辅助乙醇提取法提取多酚的最优提取工艺。利用Fenton反应法、邻苯三酚自氧化法及DPPH比色法分析法测定玄米茶多酚对羟自由基（·OH）、超氧阴离子自由基（O2-）和DPPH自由基的清除能力，从而揭示玄米茶多酚的抗氧化活性，以期为玄米茶多酚的高效提取和深度开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

玄米茶（陌上花开茶叶有限公司）；没食子酸标准品（天津市大茂化学厂）；福林酚、无水碳酸钠、硫酸亚铁、水杨酸、L-抗坏血酸、盐酸（分析纯，天津市大茂化学厂）；无水乙醇（分析纯，赤峰瀚森化工有限公司）；过氧化氢（分析纯，上海恤世科学技术有限公司）；邻苯三酚（分析纯，上海蓝季科技发展有限公司）；DPPH（北京谨明生物科技有限公司）。

1.2 仪器与设备

XL30C型多功能粉碎机（山东福鑫机械有限公司）；KQ-50DA型数控超声波清洗器（北京海天友诚科技有限公司）；SHZ-95B循环水式真空泵（山东科博仪器有限公司）；PHS-3C型PH计（上海本昂科学仪器有限公司）；SHZ-B型恒温水浴锅（青岛明博环保科技有限公司）；TDL-80-2B型多管架自动平衡离心机（上海安亭有限公司）；723PC型紫外可见分光光度计（青岛明博环保科技有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 没食子酸标准曲线的绘制

配制质量浓度为0，0.01，0.02，0.03，0.04和0.05 mg/mL的没食子酸溶液，并加入0.25 mL福林酚试剂，振荡均匀后静置3 min。向上述样品中加入2 mL 15%Na2CO3溶液，避光静置30 min。以蒸馏水作为空白对照，在波长760 nm处测定样品的吸光度，试验平行测定3次，取平均值。以没食子酸浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制没食子酸标准曲线[10]，最终的线性回归方程为y=14.189x+0.005 3（R2=0.993 1）。

1.3.2 玄米茶多酚的提取

使用多功能粉碎机将玄米茶粉碎，取0.5 mg玄米茶粉末，按照不同的乙醇体积分数、料液比、超声时间和超声功率处理后，吸取1 mL浸提液并加入0.25 mL福林酚试剂，振荡均匀，放置3 min。向样品中加入2 mL 15% Na2CO3溶液，静止30 min，按3 500 r/min离心3 min，使用紫外分光光度计在波长760 nm处测定样品吸光度，玄米茶多酚提取率按式（1）计算[11]。

式中：W为多酚提取率，mg/g；C为多酚质量浓度，mg/mL；V为提取液体积，mL；n为稀释倍数；m为玄米茶粉末质量，g。

1.3.3 单因素试验设计

为探究不同工艺参数处理对玄米茶多酚提取率的影响，试验选择工艺参数超声功率（200，250，300，350和400 W）、超声处理时间（20，40，60，80和100 min）、乙醇体积分数（40%，50%，60%，70%，80%）和料液比（1∶10，1∶20，1∶30，1∶40和1∶50 g/mL）为变量进行单因素试验。

1.3.4 响应面试验设计

在单因素试验基础上进行响应面分析。选择超声功率、超声时间、乙醇体积分数、料液比为试验因素，每个因素选择3个水平，进行Box-Behnken中心组合试验。通过响应面法分析的结果找到最优的处理参数。因素与水平见表1。

表1 Box-Behnken设计试验因素与水平表

1.3.5 体外抗氧化活性试验设计

以VC为对照，分别配制0.1，0.2，0.3，0.4和0.5 mg/mL的最优提取条件下的玄米茶多酚提取液和VC溶液，采用Fenton反应法[12]、邻苯三酚自氧化法[13]和DPPH-比色法[14]测定其对·OH、O2-和DPPH的清除率，从而评价玄米茶多酚的抗氧化活性。

1.4 数据分析

每组数据均重复3次取平均值，响应面试验设计及分析采用Design-Expert 8.0.6软件，抗氧化数据采用Office 2019进行处理，P＜0.05时被认为差异显著。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 料液比对玄米茶多酚提取率的影响

料液比对玄米茶多酚提取率的影响见图1。结果显示随着液体占比的增加，玄米茶多酚提取率先增加后减少，料液比1∶30 g/mL时，玄米茶多酚提取率达到最大值，为16.5 mg/g。提取溶剂比例增加有助于玄米多酚的溶解和提取，然而比例过大时会导致其他杂质溶解，反而会阻碍多酚的溶出，导致提取率下降[15]。因此，最佳料液比为1∶30 g/mL。

图1 料液比对玄米茶多酚提取率的影响

2.1.2 超声处理时间对玄米茶多酚提取率的影响

超声处理时间对玄米茶多酚提取率的影响见图2。超声处理时间80 min处，玄米茶多酚提取率最大，为13.8 mg/g。但随着提取时间的增加，茶多酚含量逐渐减少，其原因可能是超声波热效应会导致玄米茶中一些不稳定的多酚转化成其他物质[16]，最终使得玄米茶多酚提取率变小。因此，选择超声处理时间80 min最合适。

图2 超声处理时间对玄米茶多酚提取率的影响

2.1.3 超声功率对玄米茶多酚提取率的影响

超声功率对玄米茶多酚提取率的影响见图3。超声波功率350 W时，玄米茶多酚提取率最大，为9.78 mg/g；超声功率继续增大，多酚的提取率减少。研究表明，发生此现象的原因可能是在超过一定范围后，过大的超声功率会破坏多酚结构，最终导致多酚提取率的降低[17]。因此，超声功率350 W为最佳。

图3 超声功率对玄米茶多酚提取率的影响

2.1.4 乙醇体积分数对玄米茶中多酚提取率的影响

多酚类物质会通过化学键与一些大分子物质形成复合物，如果乙醇体积分数过低而水分高时，对化学键的破坏作用过小，便会不易溶出多酚类物质；乙醇体积分数升高时，脂类、色素等杂质就会被溶解，与多酚物质一样和乙醇水分子进行结合，会降低多酚活性物质的溶解度，进而会影响多酚物质的提取率[18]。乙醇体积分数对玄米茶中多酚提取率的影响见图4。玄米茶中多酚提取率随着乙醇体积分数的增加先增加后下降，乙醇体积分数达到70%时，玄米茶中的多酚提取率达到最大值，为8.09 mg/g。

图4 乙醇体积分数对玄米茶多酚提取率的影响

2.2 响应面结果与分析

2.2.1 回归方程的建立与分析

在单因素试验基础上，以玄米茶多酚提取率为响应值，利用Design Expert 8.0.6软件对数据进行分析[18]。响应面设计和结果见表2，方差分析结果见表3。

表2 Box-Benhnken试验设计及响应结果

表3 方差分析

从表3可以看出：回归模型P＜0.000 1，极其显著；失拟项无显著性差异（P=0.715 4＞0.05）。另外，R2=0.989 1，Radj2=0.978 2，C.V.=2.80%被确定为该模型的参数，表明回归模型拟合良好[19-20]，检验误差小。根据回归系数，得到玄米茶多酚提取率的二次多元回归方程：Y=33.53+1.99A+0.25B+0.59C+4.63D-0.50AB-0.12AC-0.85AD-2.50×10-3BC-0.087BD+5.0×10-3CD-4.13A2-4.53B2-4.44C2-5.30D2。

由表3中方差分析结果可以看出，超声辅助乙醇提取玄米茶多酚的各种工艺参数中，对多酚提取率的影响顺序为乙醇体积分数（D）＞A（料液比）＞超声功率（C）＞超声时间（B），其中A（料液比）和D（乙醇体积分数）对多酚提取的影响达到极显著的水平，C（超声功率）对多酚提取的影响也达到了显著的水平。综合考察AB、AC、AD、BC、BD、CD交互项对玄米茶多酚提取率的影响，得出其中AD达到显著水平。

2.2.2 两因素交互作用响应面分析

根据回归方程绘制三维响应面图。通过观察响应面的变化和稀疏性，揭示各种因素之间的相互作用对玄米茶多酚提取率的影响，三维响应面图的结果如图5所示。

图5 两因素交互作用对多酚提取率的响应面图

图5（c）的坡度较陡峭、等高线较密集，响应面斜率越大，轮廓线越密集，形状呈扁平圆形或马鞍形，说明2个因素之间的相互作用对多酚的提取影响越大，则可以表明料液比（A）和乙醇体积分数（D）的2个交互项对玄米茶多酚提取率的影响作用明显，与表3分析结果一致。

2.2.3 最佳条件的确定和模型的验证

通过对比响应面图的结果，并运用Design-Expert 8.0.6软件对二次多项式试验模型进行优化，确定超声辅助提取玄米茶多酚的最佳工艺参数：超声功率353.19 W、超声时间80.24 min、料液比1∶31.96 g/mL、乙醇体积分数74.21%，并预测多酚提取率，结果为34.723 1 mg/g。考虑到试验设备的实际情况和可操作性，最佳工艺参数为超声功率350 W、超声时间80 min、料液比1∶32 g/mL、乙醇体积分数74%。在此条件下，3次试验的提取率平均值为34.76 mg/g，与预测值接近，说明该模型可靠。

2.3 抗氧化分析

2.3.1 玄米茶多酚对·OH的清除能力

玄米茶多酚对·OH的清除能力如图6所示。随着玄米茶多酚质量浓度的增加，其对·OH的清除率也不断提高，玄米茶多酚质量浓度0.5 mg/mL时，对·OH的清除率达82.01%。虽然玄米茶多酚对·OH的清除率略低于同浓度下VC清除率，但VC属于强抗氧化剂，因此玄米茶多酚对·OH的清除率仍较高。此外，邢敏等[19]利用超声辅助法提取杜仲雄花多酚时发现，0.5 mg/mL的提取物对·OH的清除率为72.01%，低于试验中玄米茶多酚的·OH清除率。

图6 玄米茶多酚·OH清除率的影响

2.3.2 玄米茶多酚对O2

-的清除能力

玄米茶多酚对O2-的清除能力如图7所示。玄米茶多酚浓度与对O2-的清除能力呈现一定线性关系，玄米茶多酚浓度0.5 mg/mL时，清除率最高，达到82.57%。略低于VC的清除活性。研究发现0.5 mg/mL的胎菊多酚、大麦多酚和杜仲胸花多酚对O2-的清除分别为23.08%，19.31%和32.33%，均低于玄米茶多酚对O2-的清除能力[19-21]。

图7 玄米茶多酚对O2-清除率的影响

2.3.3 DPPH自由基清除作用

玄米茶多酚对DPPH自由基的清除能力如图8所示。玄米茶多酚对DPPH自由基的清除能力随着玄米茶多酚质量浓度的增加而提高，玄米茶多酚质量浓度0.5 mg/mL时，其对DPPH自由基清除率达95.33%，与强抗氧化剂VC对DPPH自由基的清除率相比没有显著性差异（P＞0.05），可见玄米茶多酚对DPPH自由基具有强的清除能力。

图8 玄米茶多酚和VC对DPPH自由基清除率的影响

3 结论

利用超声辅助法提取玄米茶多酚，对其提取工艺进行优化，并对提取物的抗氧化活性进行评估。响应面分析方法对玄米茶多酚超声提取工艺参数进行优化，并得出最佳工艺参数：超声功率350 W、超声时间80 min、料液比1∶32 g/mL、乙醇体积分数74%。在此工艺条件下，玄米茶多酚提取率为34.76 mg/g。探索玄米茶多酚的体外抗氧化活性，结果表明，玄米茶多酚浓度0.5 mg/mL时，其对·OH、O2-和DPPH自由基的清除率分别为82.01%，82.57%和95.33%，说明玄米茶多酚具有良好的体外抗氧化活性。试验结果为玄米茶多酚的提取工艺优化提供数据支持，为将玄米茶多酚开发成具有抗氧化活性的功能食品或天然抗氧化剂提供理论依据。