橘皮总多酚的提取及其抗氧化活性研究

陈江龙，吴丽丽，周丽红，李莎

遵义医科大学（珠海校区）生物工程学院（珠海 519041）

橘子，又称为“桔子”，为常绿乔木、朱橘等各种橘类成熟后的果实，色泽鲜亮，酸甜可口，是日常生活中最受人们欢迎的水果之一，其肉、皮、络、核、叶等都能入药。橘皮在中药中又被称为陈皮，研究表明橘皮中含有多种天然功能成分，如橘皮多糖、橘皮精油、橘皮果胶、橘皮色素、橘皮多酚、橘皮黄酮等[1]，使其具有祛痰止咳、消食开胃、降血压、抗氧化、抑菌等功效[2-3]，被认为在医药、食品和化妆品等行业具有广泛的应用价值。

多酚是一种具有多元酚结构、相对分子质量在500～3 000之间的次生代谢物，具有重要的生理意义和形态意义，在植物成长中起保护作用，并可影响植物颜色和感官特征。此外，研究报道植物多酚具有抗癌、抗血栓、抗氧化、抗微生物、心脏保护和防治血管舒张等多种生理特性[4-10]。其中，抗氧化活性是植物多酚利用最广的药理作用之一，携带酚羟基的天然多酚类化合物具备良好的抗氧化性，故其对自由基（如活性氧）有较强的清除能力[11]。我国橘子产量很大，但是绝大部分橘皮被直接丢弃，不仅浪费资源，且会造成环境污染。试验以橘皮为原料，95%乙醇为提取剂，提取橘皮中总多酚物质，并研究橘皮总多酚分别对2, 2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-硝酸）二铵盐自由基（ABTS+·）、1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基（DPPH·）、羟自由基（·OH）和2-苯基-4, 4, 5, 5-四甲基咪唑啉-3-氧代-1-氧自由基（PTIO·）的清除作用，以评价其抗氧化活性。试验旨在为橘皮的高值化利用提供理论基础，并为橘皮的附加价值和利用前景提供参考[12]。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂

柑橘[市售，产于粤东，橘皮洗净去掉白色橘络自然晒干，粉碎过0.250 mm孔径（60目）筛备用]；没食子酸（HPLC≥98%）、无水碳酸钠、维生素C、无水碳酸钠、福林酚、碳酸亚铁、过硫酸钾、水杨酸、DPPH等（上海源叶生物科技有限公司）；无水乙醇（麦克林生化科技有限公司）；ABTS（上海阿拉丁生化有限公司）。所用试剂均为分析纯或分析纯以上级别。

1.2 仪器与设备

超声波清洗机（SB-5200DTD，宁波新芝生物科技股份有限公司）；离心机（TG16-WS，湖南湘仪离心机有限公司）；万分之一电子天平（BSA 224S，德国赛多利斯公司）；酶标仪（MULTISKAN GO，美国ThermoFisher公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 橘皮总多酚的提取

将橘皮洗净，去白色橘络后自然晒干，用九阳榨汁机打碎过0.250 mm孔径（60目）筛。称取20 g粉碎橘皮加入装有95%乙醇的锥形瓶内（200 mL），振荡摇匀，超声（60 ℃，300 W）浸提60 min直到乙醇变亮黄色。浸提结束后，离心（4 000 r/min，10 min），取亮黄色上清液作为待测物，旋转蒸发95%乙醇溶液，得到1.050 g暗黄色液态浸膏。取提取物浸膏，用95%乙醇稀释成不同浓度，并用于后续测其抗氧化活性。

1.3.2 没食子酸标准曲线的绘制

参考李梅梅等[13]的方法进行部分修改，使用福林酚法测量橘皮总多酚含量。将没食子酸标准品精密称取5 mg，放入蒸馏水中混合均匀后定容，配制成1 mg/mL标准溶液，将质量浓度依次稀释为40，60，80，100和120 μg/mL，备用。移取200 μL不同质量浓度标准溶液，分别与100 μL福林酚（10%，V/V）混合均匀，和100 μL 7.5% Na2CO3混合反应，置于暗处室温下显色30 min。显色后，通过酶标仪检测样品在波长765 nm处吸光度，根据检测数据绘制没食子酸标准曲线。

1.3.3 总多酚浓度测定

将1.3.1中配制的橘皮总多酚乙醇溶液，根据没食子酸标准曲线测定方法，在波长765 nm处测定提取液样品吸光度，并计算提取液中橘皮总多酚质量浓度，将得到数据代入式（1）计算橘皮总多酚提取率（X，%）。

式中：C为提取液质量浓度，μg/mL；n为提取液稀释倍数；V为提取液的体积，mL；m为晒干橘皮粉末的质量，mg。

1.3.4 橘皮总多酚抗氧化活性测定

1.3.4.1 ABTS自由基清除活性测定

参考Li等[14]的方法进行部分修改。将二铵盐ABTS精密称取3 mg，与0.735 mL蒸馏水混合反应，配制7.4 mmol/L的ABTS二铵盐溶液，备用。精密称取5 mg K2S2O8，与1.43 mL蒸馏水混合溶解，配制13 mmol/L的K2S2O8溶液，备用。用移液管移取等体积的ABTS二铵盐储备液和K2S2O8储备液，在暗处室温下反应1 h，用磷酸盐缓冲液（pH 7.4）将混合液稀释，使其在波长734 nm处吸光度约0.7，得到ABTS自由基溶液（现配现用）。精密移取800 μL ABTS自由基工作液，分别与200 μL不同质量浓度（0.05，0.10，0.15，0.20，0.25，0.30，0.35，0.40，0.45和0.50 mg/mL）的橘皮总多酚-乙醇溶液混合，室温暗处作用30 min。维生素C处理组设置为阳性对照组，95%乙醇处理组设置为样品对照组，去离子水处理组设置为空白对照组，通过酶标仪检测样品在波长734 nm处吸光度。ABTS自由基清除率（%）按式（2）计算。

式中：AABTS为不加样品扣空白对照后的吸光度；A样品为加样品扣空白对照后的吸光度。

1.3.4.2 DPPH自由基清除活性测定

参照薛海平等[15]方法，略有修改。称取DPPH固体于15 mL离心管中，加入95%乙醇溶解，配制0.1 mg/mL的DPPH溶液。移取800 μL配制好的溶液，分别与200 μL不同质量浓度（0.05，0.10，0.15，0.20，0.25，0.30，0.35，0.40，0.45和0.50 mg/mL）的橘皮总多酚-乙醇溶液混合，室温暗处下作用30 min。维生素C处理组设置为阳性对照组，95%乙醇处理组设置为样品对照组，去离子水处理组设置为空白对照组，通过酶标仪检测样品在波长519 nm处吸光度。DPPH自由基清除率（%）按式（3）计算。

式中：ADPPH为不加样品扣空白对照后的吸光度；A样品为加样品扣空白对照后的吸光度。

1.3.4.3 OH自由基清除活性测定

参照高子怡等[16]方法，略有修改。移取200 μL不同质量浓度（0.05，0.10，0.15，0.20，0.25，0.30，0.35，0.40，0.45和0.50 mg/mL）的橘皮总多酚-乙醇溶液，分别加入160 μL FeSO4（3.2 mmol/L）和160 μL H2O2（18.2 mmol/L）溶液均匀混合，置于室温暗处下反应10 min。加入480 μL水杨酸-乙醇溶液（3.6 mmol/L）混合摇匀，置于暗处室温下反应30 min。维生素C处理组设置为阳性对照组，95%乙醇处理组设置为样品对照组，去离子水处理组设置为空白对照组，通过酶标仪检测样品在波长510 nm处吸光度。OH自由基清除率（%）按式（4）计算。

式中：AOH为不加样品扣空白对照后的吸光度；A样品为加样品扣空白对照后的吸光度。

1.3.4.4 PTIO自由基清除活性测定

称取5 mg的PTIO固体加入20 mL 95%乙醇中充分混合溶解，配制PTIO测试液。移取800 μL配制好的PTIO溶液，分别与200 μL不同质量浓度（0.05，0.10，0.15，0.20，0.25，0.30，0.35，0.40，0.45和0.50 mg/mL）的橘皮总多酚-乙醇溶液混合摇匀，置于暗处室温下作用30 min。维生素C处理组设置为阳性对照组，95%乙醇处理组设置为样品对照组，去离子水处理组设置为空白对照组，通过酶标仪检测样品在波长557 nm处吸光度。PTIO自由基清除率（%）按式（5）计算。

式中：APTIO为不加样品扣空白对照后的吸光度；A样品为加样品扣空白对照后的吸光度。

1.3.5 数据处理

测量数据为3次重复的Mean±SD。使用GraphPrism 5软件对数据进行统计分析并绘制图表。

2 结果与分析

2.1 没食子酸标准曲线绘制

横坐标x为没食子酸质量浓度C（mg/mL），纵坐标y为765 nm处吸光度A，经过分析计算可得出线性回归方程y=0.013 3x-0.102 5，相关系数R2=0.998 2，说明标准样品在测定浓度范围内线性关系良好。

图1 没食子酸标准曲线

2.2 总多酚含量的测定

利用式（1）及2.1中得到的线性回归方程，计算得到橘皮总多酚提取率，结果为1.77%。

2.3 抗氧化活性的评价

2.3.1 ABTS+自由基清除率测定

经活性氧化的ABTS会产生稳定的ABTS+自由基，当被清除剂作用时，清除剂会与ABTS+自由基产生反应而得到浅色溶液。由图2可知，随着橘皮总多酚质量浓度逐渐增加，ABTS+自由基清除率也逐渐上升。橘皮总多酚质量浓度在10～100 μg/mL时，其对ABTS+自由基的清除率为8.74%～90.00%。维生素C质量浓度在10～30 μg/mL时，ABTS+自由基清除率从68.41%上升至99.93%。质量浓度30～100 μg/mL时，清除率达100%。由此可见，橘皮总多酚对ABTS+自由基具有较强的清除能力，但弱于维生素C。

图2 ABTS+自由基清除率

2.3.2 DPPH自由基清除率测定

DPPH是一种在波长519 nm处有较强吸光度的紫色溶液，被自由基清除剂充分作用时，将变成无色物质[17-18]。由图3可知，橘皮总多酚质量浓度从20 μg/mL上升至100 μg/mL时清除率逐渐上升，最大可达86.88%，而维生素C质量浓度为10～20 μg/mL时，清除率由66.27%迅速增长到96.25%。由此可见，橘皮总多酚提取物对DPPH自由基具有较强的清除能力，但仍比同等浓度下维生素C能力弱。

图3 DPPH自由基清除率

2.3.3 OH自由基清除率测定

OH自由基具有短寿命而高反应活性的特性，其与水杨酸反应可生成紫色化合物，在波长510 nm处此化合物可达到吸收峰，根据测量可知吸光度与羟自由基含量呈良好的线性关系[19]。如在反应体系中加入自由基清除剂，可发现反应体系颜色变浅或者消失。由图4可知，质量浓度10～100 μg/mL时，随着橘皮总多酚和维生素C浓度的增加，其对OH自由基的清除率未发生太大变化，这可能与OH自由基寿命短的特性有关。此外，橘皮总多酚与同等浓度维生素C对OH自由基的清除率无太大区别，基本保持在40%左右，表明橘皮总多酚提取物对OH自由基具有一定清除能力，且与同等浓度下维生素C能力相当。

图4 OH自由基清除率

2.3.4 PTIO自由基清除率测定

通过水解处理后的PTIO会产生蓝紫色溶液，与抗氧化剂反应时，溶液颜色会变浅，PTIO自由基较稳定，可以长时间存在于不同pH溶液中，其清除效率与溶液pH有关[20]。由图5所示，PTIO清除率没有随着橘皮总多酚质量浓度的增大而增大，清除率在2.71%～6.78%浮动，而维生素C对PTIO清除率则随着质量浓度的增大而逐渐增大，最大清除率达99.15%。与维生素C相比，橘皮总多酚对PTIO清除率则很低。结果表明所提取的橘皮总多酚对于氧自由基的清除能力较弱。

图5 PTIO自由基清除率

3 结论

以橘皮为原料，采用溶剂超声浸提法提取橘皮总多酚，并研究其抗氧化活性。结果表明所提取的橘皮总多酚对ABTS+、DPPH、OH、PTIO自由基表现出不同程度的清除能力。同等浓度下其对ABTS+和DPPH这2种自由基的清除能力更强，对OH和PTIO这2种自由基的清除能力相对较弱。表明所提取橘皮总多酚对氮自由基的清除能力优于氧自由基。科学开展橘皮总多酚生物学活性研究，以便更加充分、准确地利用这一大量的绿色资源，不但能对人民健康提供保障，还可以创造可观的经济效益。