黑松露成分TaqMan 探针实时荧光PCR 检测方法的建立与应用

杨爱馥，孙 赟，万 超，刘雪华，邰丽梅，王 玫*

（1 大连海关技术中心 辽宁大连 116001 2 中华全国供销合作总社昆明食用菌研究所 昆明 650033）

块菌（Tuberspp.），在商业上称为松露，是一类生于地表下与树木共生的、珍贵的食药用真菌[1]。松露具有独特的香气和风味，营养价值高，是美食界的顶级食材，在欧美被冠以“地下黄金”“上帝的食物”“黑色金刚石”等美称，尤以法国黑孢块菌（T.melanosporum）和意大利白块菌（T.magnatum）最为矜贵[2-3]。以印度块菌复合群（T.indicumcomplex）为代表的中国黑松露（黑块菌）主要分布于我国西南地区（云南和四川），是块菌属在我国产量最大、分布最广且大宗出口的野生贸易食用菌种类。主要包括印度块菌（T.indicumCooke & Massee）、T.sinense、喜马拉雅块菌（T.himalayense）[4]、假喜马拉雅块菌（T.pseudohimalayense）[5]和T.formosanum[6]5 个菌种[1，7]。

作为欧洲黑松露的替代品，自20 世纪90 年代初以来，亚洲黑松露已出口到欧洲，并在当地市场销售[8]。中国松露贸易种印度块菌复合群（T.indicumcomplex）是由一类形态上高度相似、基因序列相似度高的2～4 个隐形种组成。基因图谱显示，中国的印度块菌（T.indicumCooke & Massee）和法国黑孢松露的基因相似度达到96%以上，二者在子囊果形态及孢子显微特征方法极为相似[1]，香味和营养价值也几乎没有区别。基于形态学和分子序列特征，证实属于该复合群的假凹陷块菌（T.pseudoexcavatum）和假喜马拉雅块菌（T.pseudohimalayense）为同种[1，7，9-10]，中国块菌（T.sinense）作为印度块菌（T.indicumCooke & Massee）的异名[1，7，9-14]，T.formosanum是喜马拉雅块菌（T.himalayense）的异名[7，11-15]。

松露的生长需要极其特殊的生长环境，无法进行人工培育且产量稀少，导致其价格昂贵，具有极高的经济价值。此外，黑松露除了含有丰富的蛋白质、氨基酸（包括人体不能合成的8 种必需氨基酸）、不饱和脂肪酸、维生素、微量元素外，还具有良好的生物活性，主要活性成分有块菌多糖、神经酰胺、α-雄烷醇、麦角甾醇等[16]，不仅具有抗氧化、抗诱变、抑菌、抗肿瘤等方面的药理作用，还具有调理内分泌，防治心脑血管疾病，增强免疫力，抗衰老，抗疲劳等方面的营养保健价值[17-21]。

黑松露在国际市场上长期受到追捧，价格居高不下，其经济价值日益突显。中国产黑松露大约是全球产量的40%以上，是出口欧洲的主要菌类食品。目前尚无黑松露的检测标准，市场上销售的黑松露制品真假难辨，其进出口贸易受到一定的制约。本研究靶向黑松露物种特异序列，建立一种快速、精准鉴定黑松露成分的分子生物学检测方法，以适用于黑松露及其制品鉴伪的定性检测。

1 材料与方法

1.1 试验材料

广泛收集黑松露样品及其它食用菌和异源性动植物样品，样品采集信息见表1。采用ITS 和LSU（Nuclear large submit ribosomal DNA，核糖体大亚基）基因序列[22]做分子鉴定标记，分别用引物ITS5/ITS4 和LR0R/LR5 对样品进行PCR 扩增，测序后登陆NCBI 数据库进行BLAST 比对，以进行样品真实性鉴定。

表1 样品信息表Table 1 Sample information

1.2 试剂与仪器

动物源性植物饲料基因组DNA 提取试剂盒，天根生化科技（北京）有限公司；Premix ExTaqTMProbe qPCR，宝生物工程（大连）有限公司；合成引物、探针及测序，华大基因有限公司。

QuantStudio 6 Flex QS6 实时荧光定量PCR仪，美国ABI 公司；NanoDrop Lite 超微量分光光度计，美国ThermoFisher 公司；5415R 小型高速离心机，德国Eppendorf 公司；WNB7 恒温水浴锅，德国Memmert 公司。

1.3 方法

1.3.1 DNA 提取 按照试剂盒操作说明进行DNA 提取，并进行DNA 纯度及浓度的测定。

1.3.2 引物和探针设计 从GenBank 上查找并下载印度块菌（T.indicumCooke ＆ Massee）、中国块菌（T.sinense）、喜马拉雅块菌（T.himalayense）、假凹陷块菌（T.pseudoexcavatum）、假喜马拉雅块菌（T.pseudohimalayense）和黑孢块菌（T.melanosporum）以及网盖牛肝菌（Boletus reticuloceps）、皱盖疣柄牛肝菌（Leccinum duriusculum）、黑斑厚瓤牛肝菌（Hourangia nigropunctata）、褐牛肝菌（Boletus aereus）、黑木耳（Auricularia auricula）、香菇（Lentinula edodes）、羊肚菌（Morchella sextelata）等物种的ITS 基因序列。使用Clustal X软件进行序列比对，根据差异性原则，利用Primer Premier 5.0 软件在黑松露与其它食用菌序列的差异处设计特异性引物和探针，并在GenBank 上进行Blast 比对检测引物和探针的可行性。序列如下：上游引物：5’-CTGTTCGAGCGTCACTACACAC-3’；下游引物：5’-TGATATGCTTAAGTTCA GCGGGTA-3’；探针：FAM-5’-CAATATTTGTG GTCTTGGCAGGAGTGAATT-3’-TAMRA。

1.3.3 实时荧光PCR 检测方法建立 实时荧光PCR 反应体系25 μL，包括：PCR 反应混合液（2×）12.5 μL、上游引物（10 μmol/L）1.0 μL、下游引物（10 μmol/L）1.0 μL、TaqMan 探针（10 μmol/L）0.5 μL、DNA 模板2.0 μL、无菌水将体系补充至总体积25 μL。

扩增条件为：95 ℃预变性10 min（1 个循环）；95 ℃变性5 s，60 ℃退火30 s（40 个循环），荧光阈值为设备默认值，在每个循环退火阶段收集荧光信号。

1.3.4 特异性试验 利用1.3.1 节中的DNA 提取方法提取表1 中所列出6 种黑松露目标样品和23 种非目标源性样品的基因组DNA，并以此为模版进行实时荧光PCR 扩增，以双蒸水为空白对照，验证本方法的特异性。

1.3.5 灵敏度试验 将黑松露基因组DNA 进行10 倍梯度稀释至质量浓度分别为10，1.0，1.0×10-1，1.0×10-2，1.0×10-3，1.0×10-4ng/μL，各质量浓度3 个平行进行灵敏度检测试验。

不同掺入比例模拟样品灵敏度试验：以黑松露粉为本源，分别以大豆粉和易混食用菌（黑木耳和牛肝菌混合物）为基质做添加试验，制备黑松露/基质的质量分数分别为100%，10%，1%，0.1%，0.01% 5 个不同比例的模拟样品，提取DNA 并作为灵敏度检测模板进行实时荧光PCR 检测。

1.3.6 重复性和稳定性试验 将黑松露基因组DNA 进行10 倍梯度稀释至质量浓度分别为10，1.0，1.0×10-1ng/μL，进行实时荧光PCR 检测，每个样品3 个平行，以不同浓度基因组DNA 获得的Ct值计算其平均数和变异系数，进行重复性和稳定性分析。

1.3.7 市售样品检测 购置市售黑松露鲜品（20份）、冻品（20 份）、干品（20 份），黑松露粉末（10份）、黑松露酱（5 份）和黑松露调味粉（5 份）以及不含黑松露成分的杂菌包（20 份）、杂菌碎（20 份）样品，检测其是否含有黑松露成分。同时采用DNA 条形码方法[22]对阳性样品进行ITS 基因序列扩增并测序，对比两种方法检测结果的差异。

1.3.8 数据处理 数据以“平均值±标准偏差”表示，利用Microsoft Excel 2016 对试验数据进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 真核生物18S rRNA 内参基因检测结果

以真核生物18S rRNA 基因作为内参基因对本试验所提取的所有样品DNA 溶液进行实时荧光PCR 检测，结果显示所有DNA 溶液均出现扩增曲线，Ct 值均小于30，说明所有用于黑松露成分特异性检测的DNA 样品均适用于PCR 检测（图1）。

图1 黑松露和其它样品18S rRNA 内参基因检测结果Fig.1 Detection results of 18S rRNA gene in black truffles and other materials

2.2 黑松露成分实时荧光PCR 特异性验证结果

检测收集到的6 个黑松露物种样品：印度块菌（T.indicumCooke ＆ Massee）、中国块菌（T.sinense）、喜马拉雅块菌（T.himalayense）、假凹陷块菌（T.pseudoexcavatum）、假喜马拉雅块菌（T.pseudohimalayense）和黑孢块菌（Tuber melanosporum），同时以23 种其它食用菌以及异源性动植物样品作为阴性对照，进行实时荧光PCR 扩增，检测引物和探针的特异性。结果显示，6 个黑松露物种样品印度块菌（T.indicumCooke ＆ Massee）、中国块菌（T.sinense）、喜马拉雅块菌（T.himalayense）、假凹陷块菌（T.pseudoexcavatum）、假喜马拉雅块菌（T.pseudohimalayense）和黑孢块菌（Tuber melanosporum）均出现明显的扩增曲线（图2、图3），23 种对照样品基因组DNA 均无扩增检测结果（图3），非目标源性无交叉反应，说明该方法具有很好的特异性。

图2 6 种黑松露的实时荧光PCR 特异性检测结果Fig.2 Specific detection results of 6 species of black truffles by real-time PCR

图3 黑松露的实时荧光PCR 特异性检测结果Fig.3 Specific detection results of black truffles by real-time PCR

2.3 黑松露成分实时荧光PCR 灵敏度检测

以1 μL 质量浓度分别为10，1.0，1.0×10-1，1.0×10-2，1.0×10-3，1.0×10-4ng/μL 的黑松露基因组DNA 为模板，进行灵敏度试验。结果显示该方法的最低检出限为1.0×10-3ng/μL 基因组DNA（图4）。

图4 不同DNA 浓度灵敏度检测结果Fig.4 Sensitivity test results of different DNA concentrations

黑松露样品分别与大豆基质或易混食用菌基质按不同质量分数（100%，10%，1%，0.1%，0.01%）混合，灵敏度检测试验结果如图5、图6 所示，当黑松露/基质的质量分数为0.01%时，出现典型的扩增曲线，因此该方法的灵敏度可稳定达到0.01%。

图5 模拟添加大豆粉灵敏度检测结果Fig.5 Sensitivity test results of simulated added soybean powder

图6 模拟添加易混食用菌灵敏度检测结果Fig.6 Sensitivity test results of simulated mixed edible fungi

2.4 重复性和稳定性试验

以1 μL 质量浓度范围为10，1，0.1 ng/μL 3个连续稀释梯度的黑松露基因组DNA 为模板进行实时荧光PCR 检测，每个浓度梯度进行3 次平行试验，根据Ct 值计算其平均数和变异系数，进行重复性和稳定性分析。结果显示，批内变异系数在0.47%～0.88%，批间变异系数在1.12%～2.71%（表2），说明该方法有较好的重复性和稳定性。

表2 黑松露实时荧光PCR 重复性和稳定性分析Table 2 Repeatability and stability of real-time PCR for black truffle detection

2.5 黑松露成分实时荧光PCR 法实际应用检测

对120 份市售黑松露及制品进行检测，结果见表3。商品标识为黑松露（鲜品、冻品、干片、粉末）或含有黑松露成分的样品（黑松露酱和黑松露调味粉）均出现典型的扩增曲线，阳性比例为100%，不含黑松露成分的杂菌包干货、杂菌碎干货样品均为阴性结果，检测结果与商品标识一致。同时采用DNA 条形码方法对阳性样品进行ITS基因序列扩增并测序，结果为印度块菌（T.indicumCooke ＆ Massee），说明本文建立的实时荧光PCR 检测方法结果可靠，在黑松露成分真实性鉴定中具有很强的实际应用价值。

表3 市售黑松露商品检测结果Table 3 Detection results of commercial black truffle

3 结论

本研究建立了鉴定黑松露成分的TaqMan 探针实时荧光PCR 检测方法，具有较强的特性和较高的灵敏度，与23 种其它常见食用菌和异源性动植物样品均无交叉反应，检测灵敏度可达到1.0×10-3ng/μL，黑松露基因组DNA 或质量分数0.01%的黑松露粉。对120 份市售黑松露实际样品的检测结果均与商品标识一致，黑松露检测结果的阳性样品与DNA 条形码标准方法检测结果一致，说明本方法检测结果准确可靠，适用范围从黑松露鲜品、冻品、干品到深加工黑松露制品，在黑松露成分真实性鉴定中具有很强的实际应用价值。本方法的建立将填补我国黑松露检测的空白，可作为有效的检测手段应用于口岸及市场上黑松露及制品的真伪鉴别，为标签符合性查验、打击掺假欺诈、规范市场秩序提供技术支持，对促进我国黑松露产业和进出口贸易的稳定发展具有重要意义。