有害结局路径在毒性评价与风险评估中的应用进展

苑晓燕，殷 健，范瑞祺，张婉君，彭双清，赵 君，

(1．中国人民解放军疾病预防控制中心，北京 100071；2．康龙化成/北京生物技术有限公司，北京 101100)

有害结局路径(adverse outcome pathway，AOP)框架作为新开发的毒理学评价工具，是对现有知识的概括和汇总，它将生物不同结构水平间的关联信息与实验测试、计算预测甚至是因果推理的结果充分整合，为发展和优化化学物分类方法、提出优先的体内/体外靶向测试提供了一个显而易见的基于作用机制的工作框架，对化学物有害效应和健康风险评估具有指导意义。本文整理、汇总了近年来AOP在毒性评价与风险评估领域中的应用案例与研究进展，希望为广大学者提供利用AOP解决毒理学问题的新思路。

1 AOP的定义及其对于毒性评价与风险评估的意义

AOP 是根据已有知识来描述一个直接的分子起始事件(molecular initiating event，MIE)与在生物不同结构水平(如亚细胞、细胞、组织、器官、个体、群体)所出现的与风险评估或管理决策相关的有害结局(adverse outcome，AO)之间的因果联系，串联起其中因果关系的事件又被称为关键事件(key event，KE)[1]。AOP作为一种方法学手段，为收集、整理和评估化学物质的化学、生物学和毒理学效应的有关信息提供了一个有效的方法学框架。在这个框架中，现有的知识被汇总和关联起来，有助于确定风险评估中关键的不确定性和研究的优先顺序，并为在毒理学和风险评估中更多地使用预测方法提供了基础。

尽管AOP的概念及框架较为复杂，但经评审通过的AOP能极大促进毒理学研究和简化化学品风险评估流程。AOP主要通过证据权证(weight of evidence，WOE)的方法总结现有研究数据而建立，因此对于经济合作与发展组织(Organization for Economic Co-operation and Development，OECD)认可和发布的AOP来说，这些AOP中每个关键事件均可识别或可检测，同时它们之间具有可靠的因果关系。当对目标化合物进行毒理学研究或风险评估时，研究人员仅需对涉及该化合物的AOP中有限的关键事件展开试验即可推断出最终的有害结局，因此可以极大减少实验数量[2]。另一方面，可以根据已建立的AOP 从分子或细胞水平的毒性事件推断出器官、个体或种群水平的毒性事件，而分子或细胞水平的毒性事件可通过计算机模拟(in silico)和体外试验进行预测或检测，这种检测手段费用低、周期短且符合3R原则[3]。因此，AOP推广和应用的终极目标是实现风险评估的预测。

对于毒性评价与风险评估而言，AOP的意义在于：①有助于科研人员和管理人员开展合作；②从多种来源系统地整合已有的机制信息和数据，有助于在不同生物组织水平理解有害效应的毒理学进程；③有助于开展假设驱动的毒性测试、识别风险评估中的不确定性和确定今后研究的优先顺序；④为化学物基于结构-活性关系分类提供支持，减少测试需求；⑤有效的将体外测试的数据用于决策制定。可以说，作为一个知识、信息链，AOP有效地构筑起了非动物测试替代方法与管理、预测毒理学之间的桥梁。

2 AOP在毒性评价中的应用进展

2.1 AOP可用于毒性测试方法的开发与改进

通过识别和描述关键事件，AOP 可以为测试指南计划(test guidelines programme)提供研发信息。当关键事件被确定后，就可以在细胞水平或更高生物组织水平上开发检测直接化学效应/反应的体外或离体实验方法，以及检测MIE相关靶点的筛选分析方法。2016年OECD审议通过了皮肤致敏的AOP框架来阐释皮肤过敏反应过程[4]。在该AOP 中，皮肤致敏过程包括致敏阶段和随后的免疫反应激发2 个阶段。第1 阶段包括了一系列KE，其中MIE(或KE-1)是具有亲电作用的外源化合物与表皮蛋白质亲核位点的共价结合，形成半抗原。随后触发了细胞水平的KE，即角质细胞炎症反应(KE-2)，其下游或同时发生的另一个细胞水平的KE 是树突状细胞的激活(KE-3)。接着，活化的树突状细胞迁移至局部淋巴结，将半抗原复合物呈递至T淋巴细胞，最终导致记忆T 细胞的增殖和分化这一KE(KE-4)的发生。当皮肤再次接触化学物时进入激发阶段，导致过敏性接触性皮炎发生。在此基础上，开发了针对KE-1 的直接多肽结合试验(DPRA，OECD 442C)、针对KE-2 的KeratinoSensTM试验和LuSensTM试验(OECD 442D)以及针对KE-3 的h-CLAT 试验、U-SENTM试验、IL-8 Luc试验(OECD 442E)已被OECD测试指南采纳为标准方法[4]。

2017年新修订的REACH 法规指出，需要对上述每个KE(KE-1、KE-2 和KE-3)分别进行检测才能完成对皮肤致敏终点效应的评价。但同时又指出如果已有1～2个关键事件的数据足以进行风险危害评估，则不需要再进行其他关键事件的试验[5]。随着AOP 的不断应用，越来越多的科研机构和学术团体正在探索AOP在该领域的应用。

2.2 AOP可用于有害物质的危害识别和生物标志物预测

风险评估由危害识别、危害特征描述、暴露评估和风险特征描述4个核心步骤组成。危害识别是风险评估的第一步，用以确定化学品是否会导致有害效应。该过程对毒性效应、毒性机制和毒性物质进行描述，并考虑化合物代谢及相互作用[6]。危险识别的关键组成部分包括分析作用模式(mode of action，MOA)和评估证据权重(weight of evidence，WOE)[7]。AOP 框架从化学品与受体、酶或其他生物分子的相互作用(分子起始事件)到有害结局等层面系统地构建了关键事件级联信息，提供了直观的危害识别，有助于化学品风险评估[7-8]。

除此之外，AOP还可以通过数据库比对等方法发掘生物标志物，从而提供支持化学安全评估所需的机制细节，目前已有一些研究采用AOP 对不同化学物质的共有生物标志物进行预测，例如Lee等[9]发现苯并芘、硒和纳米氧化银在水环境中具有共有的生物标志物和作用位点，Reinwald 等[10]发现3,3′,5-三碘甲状腺氨酸(T-3)和甲状腺过氧化物酶抑制剂6-丙基-2-硫脲嘧啶(6-PTU)可作为化学物对斑马鱼的内分泌干扰的潜在生物标志物。Inoue等[11]使用代谢组学的标志物预测空气污染对出生结局的影响。这些例子表明AOP可为生物标志物的筛选提供强有力的辅助和支持。

2.3 AOP有助于跨物种毒性评价和剂量外推

毒理学风险评估，一般根据高剂量给药的动物研究结果，结合人类暴露评估，通过不确定性系数或线性外推来评价特定化学品暴露的安全性[12]。跨物种外推是化学品风险评估的基础，也是风险评估中长期存在的不确定性。对于人类健康风险评估，通常是从研究充分的啮齿动物模型中外推到人类。对于生态风险评估，是从不同分类的少数模式动物中获得的毒性数据外推到整个环境中的生物。物种外推有两种方法，最基本的方法是使用安全系数法来解释物种敏感性的潜在差异。另一种方法是使用物种敏感性分布(species sensitivity distributions，SSDs)对潜在生态风险进行概率预测。其中，敏感性分布方法更为严谨，但要求较高的科学置信度和可靠的剂量-效应关系[13]，对于这种越来越严格的要求，近年来又诞生了能够同时满足定性和定量要求的定量AOP(quantitative adverse outcome pathway，qAOP)模型。qAOP 的提出有助于SSDs 方法的完善，并可帮助确定物种间外推不确定性系数的大小[14]。此外，进行跨物种外推时，除了应关注已测试的物种外，还应关注其他敏感物种，而AOP框架可用于确定需要关注的敏感物种[15]。以上进展表明，AOP框架可从作用机制和量效关系两个方面帮助实现跨物种评价和剂量外推。

2.4 AOP有助于毒性测试的筛选和优先级设置

优先级设置是应对大量化学品毒性测试中亟待解决的毒理学问题。优先排序和毒性测试筛选旨在识别给定暴露浓度下可能导致有害结果的化学品，以便对其进行更深入的测试。优先排序和毒性测试筛选通常使用体外测试来评估化学品造成内分泌干扰、神经毒性或皮肤致敏等效应的潜力[8]。在优先级排序中，首先筛选出具有可测量生物活性的物质，然后将筛选中被判定为阳性的物质从低效到高效进行排序，并根据其暴露边界比(margin of exposure，MOE)进行加权，最有效或最小MOE 的化学品具有最高优先级，然后进行更深入的评估或测试[16]。AOP有助于化学品测试优先级的设置，在AOP框架下对化学品进行筛选，可确定它们是否有可能触发特定的、可测量的生物反应，这些生物学反应可能与一个或多个MIEs、KEs或AOs有关。被确定具有不可接受的风险、导致AO 的化学品会根据其效力进行排序，其中效力最强的物质会获得最高优先级，被进行更深入的测试或评估[17]。此外，AOPs有助于根据现有数据的完整性确定关键数据缺口，随后设计基于作用机制的分层测试策略。美国EPA 内分泌干扰物筛查计划(endocrine disruptor screening program，EDSP)，在一定程度上体现了基于作用机制的测试原则在优先级设置中的应用。

2.5 AOP可用于化学物质的剂量-反应评价

除了通过MIE 和KE 帮助毒性评价确定敏感位点外，AOP框架还可通过与化学数据相结合，应用于特定化学品的剂量-反应评估[18]。在AOP框架下，研究人员可对MIE，KE或AO等不同层级的毒性终点分别进行剂量-反应评价，从而预测混合物的毒性剂量-反应关系[19]，目前已有部分基于AOP 框架对混合物剂量-反应关系的研究[20]。此外，qAOP的出现也促进了AOP从单纯定性评价转向定性和定量同时评价。Doering等[21]采用qAOP 模型预测芳香受体激动剂对鸟类和鱼类早期生命阶段死亡率的定量影响，而Villeneuve等[22]使用体外芳香化酶抑制数据预测了成年雌性鱼的短期体内剂量-反应关系，尽管目前qAOP的应用还缺乏统一的标准，但是其在剂量-反应关系的预测等方面具有巨大潜力[23]。

3 AOP在风险评估中的应用进展

3.1 AOP可用于风险评估策略的整合与优化

目前，待评价的化学品数量庞大，风险评估面临艰巨挑战，这要求用于监管的毒性测试手段要更加经济、高效。为实现这一目标，需要更合理地调配测试资源，聚焦于最受关注的化学物、最可能的作用位点及最敏感的物种。整合测试策略(integrated test strategy，ITS)或整合测试与评估策略(integrated approaches to testing and assessment，IATA)为上述测试理念提供了实际解决方案。同时，AOP框架的发展可提供MIE、KE和受到监管关注的AO 的因果关系信息，又可促进上述策略的发展，并为监管决策制定提供生物学背景。

对于任何给定的毒性终点来说，AOP可以作为建立针对该终点的IATA或ITS的基础。AOP有助于确定所需的进一步信息(或实验)，提高起始事件与有害结局关联的确定性[24]。此外，一个构建完善的AOP 也可以用于种属间的比较。目前ITS在皮肤致敏测试中得到了较为广泛的应用。皮肤致敏ITS 着重于皮肤致敏AOP 中的关键事件，基于非测试方法(计算机算法或构效模型)和测试方法(标准化方法或非标准化方法)，通过不同的组合方式以提高皮肤致敏预测的准确度、灵敏度和特异度。例如，研究人员将非动物试验的化学物辛醇水分配系数、表皮生物利用度、直接肽反应试验、KeratinoSensTM试验、U-SENTM试验和动物局部淋巴结试验(LLNA)、豚鼠最大化试验(GPMT)或Buehler试验(BT)数据以及计算机模拟的数据组合起来，以涵盖皮肤致敏AOP中各阶段生物效应的数据，从而建立皮肤致敏性评价的整合测试策略[25]。

随着评估策略的发展，基于ITS 的皮肤致敏测试也呈现出了多种组合方式，包括测试组合、权重分析、分层策略以及其他ITS 方法等[26]。此外，基于贝叶斯网络等新手段的皮肤致敏组合测试策略应用软件也在开发当中[27]。目前除皮肤致敏性测试外，其他毒性测试也逐渐开始采用ITS 策略[28]。随着ITS 与IATA 的不断完善，AOP 也会在其中发挥越来越重要的作用，为风险评估策略的整合与优化提供更多的帮助。

3.2 AOP可用于风险评估中的敏感性预测

传统的化学物毒性测试往往基于特定动物模型，使得毒性测试结果可能存在种属特异性，因此物种间的敏感性预测至关重要。近年来，AOP概念已被用于不同物种对某一化学物(如杀虫剂)毒性敏感性的预测，如Lalone等[29]比较了电压门控类钠通道(VGSC)α亚基的相似性和不同生态物种的敏感性，Pottenger等[30]利用AOP 预测了3 种潜在致癌物在大鼠和人体内致癌性的关联，Khan等[31]尝试使用双壳类动物模型中的生物标志物预测环境与人类健康风险。以上实例说明当特定物种毒性测试缺失或无法进行毒性测试时，AOP可用来进行敏感性预测。

AOP在敏感性预测中的应用说明AOP可以提供一种基于毒性通路的毒理学框架来支持危险评估和监管决策。而这种对监管决策的支持很大程度上依赖于AOP 构建过程中的科学置信度，这种科学置信度有助于特定用途的应用。然而，不论AOP是否完整且高度可信，它们对决策监管依然具有一定的参考价值，且仍可用于特定的用途。

3.3 AOP有助于定量结构活性关系分析和交叉参照

现实中往往存在着现有化学品信息不足以支撑决策建立的情况，针对这种情况，诸如定量结构活性关系分析(quantitative structure-activity relationship，QSAR)等的计算机方法应运而生[32]，这些计算方法可在产生新数据之前，优先通过交叉参照方法(read-across)对与结构相关化学品的数据合并[33]。交叉参照指的是通过一个(或多个)化合物的信息预测另一个(或多个)具有相似特性的化合物的对应信息，从而起到替代测试的作用[34]。SEURAT-1 项目(Safety Evaluation Ultimately Replacing Animal Testing)举办的研讨会讨论了AOP在交叉参照方面的应用，其目的是通过使用替代方法的结果以提高交叉参照方法的可信度[35]。具体而言，交叉参照方法的判定应该基于对毒性和毒代动力学机制的理解，并通过体外数据得到加强，而AOP的构建有助于加强这种理解，并加强交叉参照化学品数据的可信性。此外，根据对一系列案例研究的评估，欧洲化学理事会也得到类似的观点，即高置信度的AOP可对证据和数据的支持起到重要作用[36]。在实际应用方面，用于皮肤致敏的AOP 目前已被OECD组织认证并被纳入QSAR工具箱[37]，在此基础上，该AOP还被用于辅证综合测试策略，并广泛用于QSAR 和交叉参照效果的评估，这也充分体现了AOP的开发有助于此类非测试方法的应用与发展。

4 总结与展望

自2007年诞生以来，AOP这一新兴的毒理学框架在国内外蓬勃发展，不少研究人员开展了将AOP 应用于毒性预测的尝试，并将AOP的研究与发展不断深入，还进一步尝试将AOP与剂量外推，评估策略整合优化等领域。

然而目前AOP的发展还处于初期阶段，将AOP应用于毒性评价和风险评估仍有许多困难，例如量化剂量-反应关系、建立合适的毒代动力学模型、从体外系统生物学效应数据外推预测体内AO、从定性AOP 过渡到定量AOP、建立透明化评价体系等。对此，欧美国家已进行将AOP 和决策制定相结合的尝试：例如欧盟EU-TOXRISK项目就致力于建立基于AOP，整合多学科的新型毒理学安全评价方法，重点开展重复给药的系统毒性和生殖发育毒性研究[38]。美国EPA 的21 世纪毒理学测试(Toxicology Testing in the 21stCentury，Tox21)则应用AOP框架进行EDSP，旨在通过计算机模型和基于体外细胞培养的高通量筛选模型等最新技术分层收集内分泌干扰物的信息，优化法规决策，提高测试的效率和通量，并降低安全评价成本[39]。相比之下，我国在这方面仍处于学习和起步阶段，需要更多的发展与推广。相信在AOP框架下，随着人体生命科学毒性机制及其网络的阐明，以及全球性多学科技术的融合，势必给毒性评价和风险评估新体系的建立带来新的契机。