食管癌干细胞特性及相关蛋白的研究进展

闫俊涛，李洪霖，朱亚辉，常思思，高付彦，马纯政，

(1．河南中医药大学，河南 郑州 450046；2．河南省中医院/河南中医药大学第二附属医院，河南 郑州 450002)

食管癌发病率居全球癌症发病率第8位，每年造成超过50万例死亡，占全球癌症死亡总数的5.3%[1]。我国是食管癌的高发地区，2020年中国新增食管癌死亡病例数为30.1万例，占全球死亡病例的50%以上，居中国恶性肿瘤死因第4位[2]。食管癌干细胞参与并促进了食管癌的复发、转移及治疗抵抗，与食管癌的高死亡率密切相关[3]。因此，深入了解食管癌干细胞的特性及其相关的影响因素可能为食管癌的诊治提供新的方向。

1 食管癌干细胞特性

肿瘤中并非每一个细胞都有再生能力，其中一部分细胞能够自我更新，并在治疗后再生构成肿瘤的异质细胞谱系，促进肿瘤的发生、发展、耐药、复发和转移，这些细胞就是肿瘤干细胞[4]。肿瘤干细胞的几个特点如下：①自我更新能力，肿瘤干细胞可以产生与上一代相似的子代细胞，从而保持持续生长；②分化潜能，体外分化的肿瘤干细胞可形成新的肿瘤；③高致瘤性，在动物实验中，将少量肿瘤干细胞注射到动物体内时，可以生成肿瘤；④治疗抵抗，肿瘤干细胞的膜转运蛋白可摄取和分泌多种与细胞能量代谢相关的物质，导致其对多种抗癌药物产生抵抗[5]。食管癌干细胞的这些特性，促进了食管癌的发生、发展、转移与治疗抵抗。

2 食管癌干细胞特性相关蛋白

2.1 ATP结合盒蛋白G亚家族成员2

ATP 结合盒蛋白G 亚家族成员2 ( ATP binding cassette subfamily G member 2，ABCG2)是ABC细胞膜转运蛋白家族中的一员，是最重要的多药耐药转运体之一，其转运底物包括许多常用的化疗药物[6]，可以将多种内源性和外源性化合物泵出细胞，ABCG2参与的抗癌药物外排或其他机制影响了癌症的治疗效果[7]。研究[8]发现，ABCG2可能是肿瘤干细胞的一种新的生物标志物，其不仅在正常食管上皮细胞顶膜中大量表达，在食管鳞癌手术标本中也高表达，并与食管癌的病理分级、TNM分期及淋巴结转移有关。Huang 等[9]的研究发现ABCG2 的表达在肿瘤干细胞增殖、维持干细胞表型和促进肿瘤细胞发育中发挥了重要作用。

2.2 DNA甲基转移酶1

DNA 甲基转移酶1(DNA methyl transferases 1，DNMT1)在DNA 的甲基化修饰中发挥主要作用。研究发现DNMT1 的高表达可以抑制P53的转录从而促进肿瘤生长，DNMT1也参与了干细胞的干性维持，在干细胞分化过程中DNMT1 的表达呈下降趋势[10]。滕颖[11]进行了DNMT1对食管癌干细胞影响的研究，发现在抑制DNMT1 的表达后，食管癌细胞系中干细胞的比例降低，悬浮培养形成肿瘤球的数量及体积均减少，裸鼠体内形成的移植瘤体积及质量也减小，食管癌细胞的增殖、克隆、转移及耐药能力均受到抑制，干细胞标记物Sox2的表达也下降。这表明DNMT1 对于维持食管癌干细胞的数量和干细胞特性有着重要作用。最近有研究表明，新型抗癌药RX-3117可通过抑制DNMT1 直接抑制肿瘤生长，表明DNMT1 可作为一个潜在的食管癌治疗靶点[12]。

2.3 畸胎瘤衍生生长因子1

畸胎瘤衍生生长因子1(cripto-1，CR-1)是表皮生长因子富含半胱氨酸家族(EGF-CFC)的成员，能编码一种与胚胎发育有关的蛋白[13]。CR-1在成人组织中不表达，但在肿瘤细胞特别是肿瘤干细胞中重新表达[14]，促进了肿瘤细胞的增殖、存活、转移和侵袭，也促进了肿瘤组织中的血管生成。Xu等[15]发现CR-1的表达水平与肿瘤的侵袭深度、淋巴结转移、较晚的TNM分期和较差的总体生存呈正相关。

在食管癌中，CR-1 高表达的细胞系中干细胞相关转录因子Sox2、Oct4 和Nanog 的表达水平更高，而抑制CR-1 会使食管癌干细胞相关基因的表达水平显著降低，也会使食管癌细胞的自我更新能力和肿瘤球形成能力显著降低，提示CR-1 可视作食管癌干细胞的特异性标志物，且在调节食管癌细胞的干细胞特性方面发挥作用[16]。宋爽等[17]实验证实，转染CR-1基因过表达载体的食管癌干细胞的存活率明显升高，凋亡率明显降低，即CR-1 的过表达对食管癌干细胞的存活具有促进作用。Liu等[16]研究证实，CR-1还参与了诱导食管癌细胞上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)的过程，促进了食管癌干细胞的生成。最近，针对CR-1 的反义核酸技术和针对CR-1 的CfC 结构域的拮抗剂已被报道能抑制人乳腺癌、结肠癌和睾丸癌细胞的生长，提示CR-1 是针对食管癌干细胞的一个有价值的治疗靶点。

2.4 CXCL12-CXCR4趋化因子轴

趋化因子与其受体之间的相互作用在肿瘤干细胞的侵袭和转移中起着重要作用。近年来的研究发现，趋化因子配体12(CXCL12)及其同源受体(CXCR4)在肿瘤的增殖、侵袭、血管生成、微环境和化疗耐药等方面发挥了重要作用[18]。肿瘤细胞及其所处微环境产生的大量CXCL12 会促进肿瘤细胞发生EMT，也会上调肿瘤细胞上的CXCR4 来阻止细胞凋亡[19]。CXCL12 还能吸引CXCR4阳性的炎性细胞、血管细胞和间质细胞进入肿瘤组织，从而支持肿瘤的发展[18]。CXCR4是介导食管癌淋巴结转移和远处器官转移的一个主要趋化性受体，抑制CXCR4可以显著降低食管癌细胞的转移和增殖潜力，CXCR4在食管癌干细胞中的高表达促进了食管癌干细胞的远处转移，增加了食管癌的恶性潜能[19]。Wang等[20]的实验发现食管癌干细胞能自分泌大量CXCL12并高表达CXCR4，且CXCL12-CXCR4趋化因子轴对食管癌干细胞上的ERK1/2 信号通路具有激活作用，从而促进了食管癌干细胞的侵袭和转移。

2.5 YAP1-SOX9轴

Hippo 信号通路(Hippo pathway)及其转录辅助激活因子Yes相关蛋白1(Yes-associated protein 1，YAP1)是调节器官大小和增殖的主要因子，YAP1和Hippo通路的去调控在恶性肿瘤进展过程中的重要性正在显现[21]。Song等[21]研究发现YAP1驱动Y染色体性别决定区-盒转录因子9(sex-determing region of Y-box transcription factor 9，Sox9)的表达是细胞获得干细胞特性的关键，且YAP1 能通过保守的TEAD 结合位点直接上调Sox9，从而赋予多种胃肠道来源的非转化细胞(包括食管癌细胞)的干细胞特性。在这些非转化细胞中，包括肿瘤球形成、增殖和致瘤性在内的多种干细胞特性均依赖于YAP1的表达，抑制YAP1会使由YAP1-Sox9 轴诱导的食管癌干细胞的体外肿瘤形成能力、体内致瘤性和干细胞标记物的表达量显著降低。Sox9在多种癌症中被认为是肿瘤干细胞的标志，在食管癌细胞中，敲除YAP1基因会使Sox9 的表达降低，肿瘤球形成能力减弱，因此Wei等[22]认为YAP1对Sox9的激活可能是赋予食管癌细胞干细胞特性的重要因素。YAP1 抑制剂维替普芬，已被发现可抑制食管癌的肿瘤干细胞和肿瘤细胞生长。总之，YAP1-Sox9通路可以视作抑制食管癌恶性进展的基因或药理学靶点[23]。

2.6 GASC1-Notch1轴

鳞状细胞癌扩增基因1(gene amplified in squamous cell carcinoma 1，GASC1)，对维持胚胎干细胞的特征至关重要[24]。贾瑞诺[25]进行了GASC1参与食管癌干细胞维持的研究，发现对GASC1进行遗传和药理学抑制后，食管癌干细胞的数量、增殖能力、静止状态、致瘤性和侵袭转移能力均显著下降。该研究另外发现Notch1基因在食管癌细胞系的表达随着GASC1的抑制而显著下调，且Notch1基因敲减后也会引起食管癌干细胞的比例和悬浮培养成球率下降，但Notch1基因的过表达却可以补偿GASC1表达下调引起的“干细胞性削减”[25]，这表明Notch1对于GASC1诱导食管癌干细胞形成是必不可少的。Jia等[26]后续发现GASC1是通过促进Notch1启动子区域去甲基化来调控食管癌干细胞的，提示GASC1-Notch1轴参与食管癌干细胞的干性维持。

3 上皮-间充质转化

EMT是一个生物学过程，上皮细胞经历该过程会失去细胞极性，并失去与基底膜的连接等上皮细胞表型，获得较高的转移能力、侵袭性和抗凋亡能力，呈现间质细胞表型[27]，从而促进肿瘤的侵袭性和转移性生长，这可能是上皮细胞获得恶性表型的关键[28]。目前认为EMT和肿瘤干细胞之间可能存在直接关系，Liu 等[29]进行的食管癌干细胞与EMT 过程的相关性研究证实，食管癌干细胞中上皮蛋白生物标记物的表达降低，而间质蛋白生物标记物和转录因子的表达增加，表明食管癌干细胞具有了EMT 特征，抑制EMT 进程可以视作食管癌的一种潜在治疗方法。

4 缺氧微环境

各种组织的正常干细胞均处在一个微环境中，该微环境密切影响它们的生存和自我更新。有学者认为肿瘤干细胞可能也存在于特定的微环境中，使它们对放射治疗和化疗更具抵抗力，从而导致肿瘤的再生和远处转移[4]。研究发现，与正常干细胞增殖和转移密切相关的微环境组成成分或信号通路，在肿瘤细胞的侵袭和扩散中也起着关键作用[30]。缺氧已被证明是正常干细胞和肿瘤干细胞微环境的组成成分，缺氧微环境通过激活缺氧诱导因子来维持细胞静止状态而使肿瘤干细胞保持未分化状态[4]，进而诱导肿瘤干细胞的放化疗抵抗，为转移创造条件。刘灵[31]进一步明确了缺氧微环境对食管癌细胞干细胞化的影响，她发现经过缺氧培养后，食管癌细胞内的肿瘤干细胞标志物的表达量、食管癌细胞系中肿瘤干细胞的比例及食管癌细胞的体外侵袭能力均明显增加。这提示缺氧能够诱导食管癌细胞干细胞化，缺氧微环境及缺氧诱导因子对食管癌干细胞的干性维持十分重要，逆转缺氧微环境或杀灭缺氧诱导因子可视作一种潜在的食管癌治疗方法。

5 细胞静止状态与DNA损伤抵抗

增殖会诱导干细胞的分化和衰竭并增加大多数成体组织中突变的积累从而诱导细胞凋亡，而当细胞处于静止状态时DNA的复制和代谢下降，细胞凋亡明显减少。Fleming等[32]由此认为肿瘤干细胞的静止状态在肿瘤维持过程中发挥了重要作用，是肿瘤细胞躲避伤害的必要条件。Chen等[33]实验发现，与非干细胞相比，食管癌干细胞处在静止状态的细胞比例更多，对DNA损伤剂的抵抗能力更强，还能诱导DNA 损伤应答(DNAdamage response，DDR)的衰减，以此来抵抗DNA 损伤引起的细胞死亡，这可能是食管癌对放化疗抵抗的主要原因之一。

6 结 语

综上所述，分子通路、EMT、微环境、细胞静止状态和DNA损伤抵抗共同维持了食管癌干细胞的自我更新能力、分化潜能、高致瘤性和放化疗抵抗，使食管癌成为消化系统常见的高危恶性肿瘤。食管癌干细胞可视作一个潜在的治疗靶点，为改善患者预后提供了更多的可能性。