动物源医疗器械可沥滤物的研究进展

刘 璟，刘子琪，丁 黎，付步芳

(1．中国食品药品检定研究院，北京 102629；2．中国药科大学，江苏 南京 211198)

动物源医疗器械产品指全部或部分采用动物组织制成的，或取材于动物组织、动物组织衍生物或由动物体自然获取物质制成的医疗器械产品。与非动物来源的材料相比，具有更好的生物相容性和生物活性等特点[1]，使得应用领域越来越广泛，原材料的种类也越来越多。根据国家食品药品监督管理局2017年发布的医疗器械产品分类目录，动物源医疗器械产品主要有5 类，包括无源植入器械，如人工骨、心脏瓣膜、外科修复补片等；无源手术器械如胶原蛋白缝合线、羊肠缝合线；护理和防护器械，如胶原蛋白海绵、壳聚糖防黏连膜等；眼科器械，如脱细胞角膜植片、眼用透明质酸钠等；口腔科器械如生物膜、口腔修复膜等。

应用动物源医疗器械受益的同时也面临着两大风险：动物源材料特殊的免疫毒性风险和供体本身所携带的病毒等危险性因子及其外源因子污染引起的安全风险问题[1]。为有效降低动物组织带来的免疫原性，动物源产品一般需要进行脱细胞、去除杂蛋白等工序。异种产品相对非生物源产品更重视病原体带来的传播风险，需要进行严格的病毒灭活、灭菌处理。包括以上工序在内的多种加工过程中产生的加工工艺残留、灭菌残留剂等物质存在一定毒副作用，同时在医疗器械的应用中，这些物质均可能直接或通过相关介质进入人体[2-3]。上述医疗器械或材料在临床使用过程中释放出的物质统称为可沥滤物。动物源产品可沥滤物的研究为相关产品的生物学评价和毒理学风险评估提供所必需的信息，并为产品开发及优化提供支持。因此，对医疗器械的可沥滤物研究既是企业在设计开发产品阶段的研究热点，也是当下医疗器械监管和相关产品技术审评关注的重点[4-5]。

1 动物源医疗器械可沥滤物的监管现状

经国家药监局医疗器械标准管理中心网站查询，动物源医疗器械产品现行有效的相关标准有9 项，见表1(序号1～9)，与可沥滤物相关的标准有3 项，见表1(序号10～12)，迄今为止尚无关于动物源医疗器械可沥滤物具体检测方法的国家标准或行业标准。国家药监局医疗器械技术审评中心先后发布《医疗器械已知可沥滤物测定方法验证及确认注册技术审查指导原则》及《医疗器械未知可沥滤物评价方法建立及表征技术审查指导原则》(征求意见稿)后，对医疗器械的可沥滤物检测和评价要求正式作为必需的注册申报资料，大多数包括动物源在内的医疗器械均需要进行可沥滤物的控制。但目前可沥滤物的检测分析和评价方法较少，因此有必要探索建立一套科学规范的医疗器械可沥滤物的标准化检测分析方法。

2 动物源医疗器械可沥滤物的种类

动物源产品来源丰富，取材范围广泛、制备过程复杂、使用到有机溶剂等小分子物质种类较多，因此，形成可沥滤物的安全性风险更高。确定动物源医疗器械可沥滤物种类是建立可沥滤物检测分析方法的基础，常见的可沥滤物来源主要有以下几个方面。

2.1 脱细胞

为降低动物源材料在生产加工过程中可能出现残留的组织蛋白、抗原等物质带来的免疫原性风险，一般会采取脱细胞、去除杂蛋白等方法[6]。其中，天然组织材料经过脱细胞处理后，能够显著降低移植后排斥反应的发生，同时保留原有的组织结构和特性，材料表面微环境依然有利于细胞的生存。目前常用物理、化学和生物酶法等进行脱细胞处理。在组织工程心脏瓣膜去除细胞的方法主要有：胰蛋白酶法、去垢剂-酶消化法、十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate，SDS)法和去氧胆酸钠法等[7-10]。常用试剂如SDS可通过溶解细胞质和核膜，破坏蛋白质分子内和分子间相互作用导致细胞死亡，但SDS作为表面活性剂，当其到达一定浓度会产生细胞毒性和溶血作用，因此需对其残留量进行严格限制[11-12]。周建伟等[13]研究了SDS的残留量与细胞毒性的相关性，并得到对L-929 细胞和MC3T3-E1细胞产生细胞毒性的临界浓度分别为4×10-3mg/mL 和6×10-3mg/mL。

2.2 交联改性

为提高动物心脏瓣膜的稳定性，显著降低免疫原性，提高使用寿命，早在1968年Carpentier 就使用戊二醛(glutaric dialdehyde，GA)交联处理异种生物组织瓣，1970年开始，GA交联的牛心包材料制备的生物瓣膜已得到了推广[14]。目前探索的天然交联剂有去甲二氢愈创木酸、单宁酸等，化学试剂有碳化二亚胺等。因为GA 具有水溶性、价格便宜等优点，其为最先使用并且最常用的交联剂[15]。汪希铭等[16]将壳聚糖基纳米纤维膜经GA 交联处理后，稳定性得到明显改善，并且一定程度上提升了纤维膜强度和韧性。此外目前对脱细胞真皮基质等产品也常用GA 进行交联改性。然而，GA 具有较强的细胞毒性，GA交联制备的生物瓣因GA缓慢而微量的释出仍可引起细胞毒性，此外，生物瓣在体内的钙化也与GA 交联有关[17]。因此在实际应用中，醛类交联产品可以根据所需的性能来选择最优的交联剂用量，并需要对醛残留量进行严格控制和检测。

2.3 病毒灭活及灭菌

动物病原感染人早已引起社会各界的关注，禽流感、狂犬病等给人类带来不同程度的危害。动物源产品来源于动物的骨、皮肤、肌腱等组织，因此需要格外重视病毒灭活和灭菌工序，除需要满足《YY/T 0771 动物源医疗器械》等标准要求外，还要重视保护生产操作人员和环境以免造成污染[18]。常见工艺中，如环氧乙烷灭活法在骨材料中的应用，但现在应用较少；过氧乙酸-乙醇灭活法在皮肤、骨等材料中均有较好的应用；此外，过氧化氢灭活法也被广泛应用于骨、胶原材料中。研究发现[19-20]对牛腱片样品经3%过氧化氢溶液处理后，水疱性口炎病毒、甲型H1N1病毒的灭活对数值均大于4，马来源的皮质骨和松质骨颗粒及心包膜材料经3%过氧化氢溶液处理后的所有生物材料均表现出完全消除病毒感染性，单纯疱疹病毒、甲型H1N1病毒和柯萨奇病毒灭活对数值均大于4，即表明过氧化氢灭活病毒后的产品质量安全可靠。但病毒灭活的同时会对生物材料性能造成不同程度的损害，白玉龙等[19]研究表明过氧乙酸、过氧化氢、环氧乙烷等残留也会对人体产生危害，甚至会引起致癌、致畸。

动物源产品及其原材料在贮存、生产及使用等过程中产生的各种化学物质的反应产物等也需要被考虑，如2-氯乙醇为环氧乙烷灭菌过程中衍生的有机物质。经环氧乙烷灭菌的产品可能仍残留一定量2-氯乙醇[20]。对于绝大多数国内医疗器械产品的注册检验，2-氯乙醇仍是非强制性检测项目，但已有广泛的研究表明2-氯乙醇的检测需要被重视[21]。

3 动物源医疗器械浸提液的制备方法

可沥滤物的分析方法一般包括浸提液制备和可沥滤物的检测方法两部分。大部分动物源器械特别是长期植入类器械，很难获得临床实际使用时的研究数据，所以很多情况下可选择浸提方式制备浸提液，从而完成对可沥滤物的研究。由于动物源医疗器械种类繁多，因此用于可沥滤物检测的浸提液制备方法也各有不同。浸提液制备的研究主要包括：浸提介质的选择，样品浸提部位的选择，浸提方式的选择，浸提条件的选择。

3.1 浸提方式与浸提样品的选择

常用的浸提方式包括加速浸提、模拟浸提、极限浸提和加严浸提，极限浸提可建立从医疗器械或材料中浸提的最大可浸提物的量，即医疗器械或材料在临床使用寿命期间可能释放的可沥滤物量的最大量。动物源医疗器械属于持久接触或长期接触类器械，很难模拟实际使用条件，所以一般选择极限浸提。此外，可根据实际情况选择除浸提外的其他方式，如李丽花等[22]研究中由于正己烷不溶于水，而采用无机酸溶液进行样品前处理后再用静态顶空气相色谱法检测了其中的有机溶剂残留量，对于挥发性物质的研究可参考采用此法。

浸提样品与浸提方式的选择是相辅相成的[23]。浸提样品优先选择最终产品，或根据代表性部分的浸提结果推算出整个样品的结果。若终产品无法满足浸提要求，可采用相同原材料在相同工艺条件下加工成的半成品来完成浸提；若含有多种材料，选取的样品中每一组分占样品的比例需要与此组分占被测产品的比例相同。

3.2 浸提介质的选择

对于某些临床使用中仅接触单一液体体系的产品，可采用该临床接触液体作为浸提介质，对于无法模拟的介质，或者当已知可沥滤物易与介质发生反应从而造成干扰时，可选择替代溶剂。其中，在水能溶解的情况下，以水做溶剂可以更好地模拟材料植入人体情况。替代溶剂应根据可沥滤物特征进行选择，且不应与待测物发生化学反应，同时应考虑器械在临床接触介质的性质等，除此之外，材料本身的性能也应被考虑。如因生物补片与SDS结合的化学键比较牢固，使得难以检出全部的SDS残留，若用氢氧化钠或硫酸降解生物补片则会使SDS发生不可逆的化学变化，所以亚甲基蓝法不能直接用于检测SDS残留。而碳酸钠可以竞争性地与生物补片中的蛋白质结合，从而能够使SDS游离出来，同时甲醇产生的界面聚集能够加速游离[12]，因此可采用甲醇-碳酸钠混合液作为浸提介质。

3.3 浸提条件的选择

浸提体积的选择在保证浸提液能够完全浸没样品的基础上尽量减少，同时也需防止被浸提物质因浓度过大而饱和。此外可根据样品面积或质量比例加入浸提液进行浸提，如脱细胞异种皮肤、可吸收医用膜等规则片状结构产品，通常在考虑样品厚薄的基础上，按样品表面积等比例加入溶剂，同时需要根据样品临床应用部位确定按照单面或双面表面积计算。

对于浸提温度和时间，应尽可能模拟临床实际情况，如提高温度应避免使材料和目标可沥滤物发生化学变化；另外浸提比例、是否振荡、搅拌，循环、超声等都是需要结合具体产品要考虑的问题。选用的浸提条件均需要严于或等于产品在预期使用中带给患者的最大风险下的条件。如王丽等[24]测定猪心脏瓣膜假体中GA残留量时，实验显示48 h和72 h后仍能检测出GA残留，即证明在此产品中GA会持续被浸提，因此需要结合产品临床实际使用情况选择合适条件。

4 动物源医疗器械可沥滤物的检测方法

根据动物源医疗器械产品中拟研究物质的理化性质、浸提溶剂等因素，合理筛选建立合适的测定方法进行定性定量研究，同时还应考虑方法的检验精度是否满足安全性评价的要求。医疗器械的可沥滤物根据研究目标不同，可分为根据相关信息识别的已知可沥滤物和根据未知可沥滤物研究体系鉴别的未知可沥滤物。已知可沥滤物通常为调研工厂产品制备工艺获得的加工过程中所涉及的物质，而未知可沥滤物可能是包装迁移物质、加工助剂中杂质或降解产物等。

4.1 已知可沥滤物检测方法

在动物源产品中已知可沥滤物检测方法的选择上，优先选用药典、标准等公布的已有检测方法，并根据浸提液特点确定是否需要调整和优化。对新方法进行验证可参考《医疗器械已知可沥滤物测定方法验证及确认注册技术审查指导原则》。行业标准YY/T 0962整形手术用交联透明质酸钠凝胶给出了交联剂1,4 丁二醇二缩水甘油基醚(1,4-butanediol diglycidyl ether，BDDE)残留量测定的方法，付海洋等[25]则改进和优化了BDDE含量的标准检测方法。在气相色谱法中，首先对样品的酶解处理以使BDDE 更好地从凝胶内部释放，并选用乙酸乙酯对BDDE 进行萃取。此外，使用酶标仪检测法，将透明质酸酶添加到标准溶液中能够去除透明质酸酶对测定结果的影响。

对于无标准检测方法的可沥滤物，需要根据待测物质的理化性质、浸提选用溶剂等选择合适的检测分析方法并进行方法学验证及确认工作。此外，需要考虑分析方法的系统适应性，如适用于色谱法检测，通常需根据待测物沸点、极性等性质建立色谱方法，优化色谱柱类型、分流比、流速等以优化目标物质理论塔板数、拖尾因子和分离度等系统适应性指标。常用的分析技术包括气相色谱、液相色谱、色谱-质谱联用技术、电感耦合等离子体光谱分析技术(inductively coupled plasma spectrometer，ICP-Spectroscopy)等。其中气相和液相色谱及质谱主要用于分析有机可沥滤物，电感耦合等离子体原子发射光谱(inductively coupled plasma optical emission spectrometer，ICPOES)和电感耦合等离子体质谱(inductively coupled plasma mass spectrometry，ICP-MS)等主要用于分析元素可沥滤物。对于同一待测物质也可采用不同检测方法进行验证比较。如葛翠兰等[26]建立了高效液相色谱测定交联剂二乙烯基砜(divinyl sulfone，DVS)残留测定的测定方法，但前期样品处理较繁琐，朱彬等[27]则采用气相色谱法测定DVS残留量，对比可得该方法样品制备简单，取样量少。

4.2 未知可沥滤物的检测方法

随着现代分析技术及评价理念的优化，以未知可沥滤物评价体系为基础的可沥滤物研究表征体系已成为医疗器械化学表征的重要组成部分。未知可沥滤物的检测与已知可沥滤物测定的最大不同在于首先要对可沥滤物进行定性，因此需要一套确实可信而且有证据的多种分析技术的联合体系，例如色谱法与多种检测仪器结合、核磁共振和其他光谱技术等。采用未知可沥滤物扫描模式以尽可能地识别所有潜在的可沥滤物且能够为浸提物鉴别提供足够的信息，同时可进行半定量或定量分析。此外，不同分析技术获得的结果还可以用于相互印证。将未知可沥滤物转化为已知可沥滤物检测后，即可采用上述已知可沥滤物检测方法开展可沥滤物定量检测。如卢大伟等[28]根据气相色谱-质谱联用技术对透明质酸钠凝胶中未知残留物进行检测分析，并对比毒理学数据和国内外标准讨论其危害，首次发现医用透明质酸钠凝胶产品中甲醇、二甲苯和乙苯的残留，并建立了合适的方法对3种残留物进行定性及定量。

5 可沥滤物允许限量的确定方法

可沥滤物允许限量的确定是通过文献评审或毒理学试验等确定可沥滤物在预期用途下的人体可耐受的量，并通过患者体质量、应用因子等数据获得允许限量数据。目前，国家标准《GB/T16886.17-2005 医疗器械生物学评价第17 部分：可沥滤物允许限量的建立》规定了医疗器械可沥滤物允许限量的确定方法，其目的是获得标准的运用及未建立标准的限量的适当评估。该标准由国际标准ISO 10993-17：2002[29]等同转化。此外，可结合美国环境保护署(U.S. Environmental Protection Agency，EPA)公开的毒理学数据建立可沥滤物的允许限量。对于无明确毒理学数据的可沥滤物，采用毒理学关注阈值(threshold of toxicological concern，TTC)的评价方法确定可沥滤物的允许限量。可沥滤物允许限量的确定，动物源产品中毒害物质产生的确定才能够被量化，从而才能完成动物源产品的安全性评价[30]。此外，也需要不断更新和改进评估方法，以适应新的科学和技术发展，提高医疗器械和药品的安全性。

6 总结与展望

随着新型医疗器械产品不断涌现和现代科学技术的不断发展，动物源医疗器械产品应不断完善，从产品生产全过程进行质量控制，最大程度抑制相关产品在生产等过程中可能产生的风险，提升产品的质量，才能够更好地保证相关产品的安全性和有效性。

虽然不同种属及不同用途的动物源产品在质量控制上有差异，但本文对动物源医疗器械可沥滤物的分类汇总、动物源产品浸提液制备、可沥滤物检测方法及可沥滤物允许限量的确定的梳理是评价其安全有效的关键内容。动物源医疗器械可沥滤物检测技术研究的难点及关键点在于将未知可沥滤物转化为已知可沥滤物检测的过程。动物源可沥滤物检测分析技术需进一步探索，还应在该类产品的质量控制中引入更先进的分析手段，探索相关的新技术、新工具、新方法、形成新标准，研制相关标准物质，搭建医疗器械的可沥滤物检测平台，才能够改观我国动物源医疗器械可沥滤物检测分析方法匮乏的局面，从而为监管部门提供方法技术科学支撑，为相关生产企业进行产品质量控制提供标准方法。