罗氏和浩源核酸检测系统的性能比较

盛 丹

南通市中心血站检验科，江苏 南通 226014

我国常见的经血传播病毒有人类免疫缺陷病毒（HIV）、乙型肝炎病毒（HBV）、丙型肝炎病毒（HCV）等，这些病毒不但严重危害感染者的生命安全、降低生活质量，还会在社会上引起恐慌和紊乱的情绪［1-3］。我国大多数采供血机构传统的血液检测策略都是采用两种不同厂家的试剂进行酶联免疫吸附试验（ELISA），剔除人类免疫缺陷病毒抗原/抗体（HIV-Ag/Ab）、乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）、丙型肝炎病毒抗体（HCV-Ab）、梅毒螺旋体抗体（TP-Ab）阳性的血液标本。但由于ELISA 存在病毒检测“窗口期”长、免疫静默感染及病毒株变异等问题，中华人民共和国国家卫生健康委员会在原有血液检测策略的基础上，增加了一遍病毒核酸检测（NAT）。NAT直接对病原体核酸进行检测，具体检测项目为HBV-DNA、HCV-RNA、HIV-RNA，不受个体免疫反应差异的影响，并且由于其扩增放大技术，使得NAT 可以明显缩短HBV、HCV、HIV 检测的“窗口期”，具有高度的敏感性和特异性，进一步降低病毒经血传播的风险，保障了血液及血液制品的安全［4-6］。南通市中心血站在2015年引入浩源多重核酸检测系统，2017年又引入罗氏Cobas S201多重NAT系统。本研究通过收集两套NAT系统的检测数据，分析两套系统的检测性能差异及原因，现将结果报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

穿越系统中查询汇总2020 年1—12 月南通市中心血站血液标本病毒NAT的结果。所有血液标本从采集到检测报告最终发放全过程均符合我国《献血者健康检查要求》及《血站操作技术规程（2019 版）》中的相关规定，核酸标本管为含分离胶的EDTA-K2 抗凝真空采血管，所有检测均在72 h内完成。

1.2 主要仪器与试剂

Hamilton Star 汇集设备（瑞士Hamilton）、Cobas Am⁃pliPrep 全自动核酸分离纯化分析系统、Cobas TaqMan 全自动医用PCR分析系统、浩源ChiTaS BSS1200汇集和核酸提取设备（上海浩源），ABI 7500 荧光PCR 仪（美国ABI），TECAN EVO 加样器（法国Tecan），全自动酶标仪FAME24/20（法国Hamilton），全自动酶标仪BEP-Ⅲ（德国Siemens）。罗氏乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人类免疫缺陷病毒（1+2 型）核酸检测试剂盒（PCR-荧光法）（Version 2）（批号：E31914、F07571、F19971、F31699），上海浩源科技有限公司乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人类免疫缺陷病毒（1 型）核酸检测试剂盒（PCR- 荧 光 法）（批 号：MF20190505、MF20190606、MF20190607、BB20200402、BB20200603），HBsAg 诊断试剂盒（北京万泰、厦门新创），HCV-Ab 诊断试剂盒（上海科华、厦门新创），HIV-Ab 诊断试剂盒（北京万泰），HIV-Ag/Ab 诊断试剂盒（厦门新创），TP-Ab 诊断试剂盒（厦门新创，北京万泰）。

1.3 检测方法

无偿献血志愿者捐献的血液标本，首先采用两种不同厂家酶免诊断试剂盒进行HIV-Ag/Ab、HBsAg、HCV-Ab、TP-Ab 的检测，以及谷丙转氨酶（ALT）的检测，然后将酶免双阳性和ALT 阳性的标本剔除，最后余下的标本进行多重核酸混样检测。罗氏检测系统每批试验都有试剂盒自带的阴性对照1个pool，阳性对照3个pool和康彻思坦外部阳性质控1 个pool，每6 份标本混样成1 个pool 进行检测。浩源检测系统每批试验都有试剂盒自带的阴性对照1 个pool，阳性对照1 个pool 和康彻思坦外部阳性质控1 个pool，每8份标本混样成1个pool进行检测。混检无反应性的标本直接判定为阴性；混检有反应性标本需继续采用原混样检测系统进行下一步的拆分单项检测，若拆分单项检测无反应性则标本判定为阴性，若拆分单项检测有反应性则标本判定为阳性。所有ELISA 检测和NAT 检测均严格按照试剂和仪器使用说明书进行操作和结果判定。

1.4 统计学方法

采用SPSS 24.0 软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t检验。计数资料用例数和百分比（%）表示，组间比较采用χ2检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2020 年1—12 月南通市中心血站共有无偿献血志愿者血液标本97 628例，剔除酶联免疫吸附试验双试剂阳性和转氨酶不合格标本638 例，余下96 990 例标本进行核酸检测，混检反应性pool 数为136 例，拆分单检阳性标本数为78 例，总的拆分阳性率为57.35%，总的阳性检出率为0.80‰。罗氏和浩源核酸检测系统分别检测标本84 798 例和11 512 例标本，两套核酸检测系统拆分阳性率的比较，差异无统计学意义（χ2＝0.801，P＞0.05），阳性检出率的比较，差异无统计学意义（χ2＝0.167，P＞0.05）。

3 讨论

输血是临床工作中挽救患者生命和治疗疾病的一种常用有效手段，临床所用血液全部来自于无偿献血志愿者的捐献，血液是一种不可以制造，也不能用其他制品替代的宝贵资源。但血液中也会存在多种病毒，在我国最常见的主要有HIV、HBV 和HCV 等，可通过输血造成病毒的感染［7-9］。采供血机构传统的血液检测策略是采用两遍不同厂 家 的ELISA 试 剂 对HIV-Ag/Ab、HBsAg、HCV-Ab 和TP-Ab 进行检测，但ELISA 法检测病毒的“窗口期”较长，且易受病毒隐匿性感染、病毒变异株等因素干扰而造成漏检，使临床用血存在安全隐患。为了进一步提高我国临床用血和血液制品的安全性，降低经血传播疾病风险，中华人民共和国国家卫生健康委员会要求全国采供血机构在原有的血液检测策略基础上增加一遍病毒NAT。NAT 可以将HBV、HCV 和HIV 感染检测的“窗口期”由原来的56 d、70 d、22 d分别缩短至33 d、12 d、11 d；还可以减少病毒株变异、急性感染恢复期及慢性隐匿性感染等原因造成的漏检［10］。

本研究经ELISA 和ALT 检测剔除阳性标本后，采用罗氏和浩源两套NAT 系统进行病毒NAT 标本的结果进行统计分析，得知本实验室总的NAT 阳性检出率为0.80‰，这一结果低于盐城的1.56‰［11］、徐州的1.04‰［12］，高于上海的0.63‰［13］、郑州的0.66‰［14］、济南的0.37‰［15］。罗氏和浩源两套NAT 系统均可从ELISA 阴性的标本中检测出HBV-DNA 阳性标本，分别为66例和11例，罗氏核酸检测系统还检出HCV-RNA 阳性标本1 例，这些数据表明增加NAT可明显降低肝炎病毒经血传播的风险。两套NAT系统虽然所检测的标本并不尽相同，标本数量也存在明显差异，导致统计分析所收集的数据可能会有一定偏差。但是，它们所检测的标本均采集于同一地区、同一时间段的无偿献血志愿者，从血液的采集到检验均严格按照血站操作技术规程执行，因此降低了其影响，具有一定的参考意义和价值。罗氏和浩源两套NAT 系统拆分阳性率分别为57.26%、57.89%，表明两套系统检测的重复性接近。两套系统标本阳性检出率分别为0.79‰、0.90‰，符合同一地区、同一时间段人群感染概率应接近。两系统与其他研究者统计的罗氏阳性检出率0.60‰［16］、0.64‰［17］，浩源阳性检出率0.90‰［16］、0.74‰［18］相比，结果也均相近。两套系统可以互为备用设备，满足应急要求，同时可用于日常无偿献血志愿者的血液筛查工作。

罗氏和浩源均为多重NAT系统，即同一反应管中同时进行HBV-DNA、HCV-RNA、HIV-RNA 多个核酸靶标扩增与检测的技术，并能根据荧光标记区分具体的检测项目。实验过程具有简便、快速、高通量的优势，能满足采供血机构大规模血液筛查的需求。两套系统相比较，罗氏NAT 系统全自动化程度更高，提取与扩增体系的全封闭性也更好，同时实验结果的判定有计算机系统的二次判读，人为影响因素更少，结果更稳定。浩源NAT系统部分试剂需检验人员进行配置，标本提取完毕后需人工转运扩增条至扩增区，最终检测结果的判定也需检验人员根据检验规则进行判读，人工参与度相对较高。在核酸检测靶标方面，罗氏系统除检测HIV-RNA1 型还进行HIV-RNA2 型的检测，对HIV 病毒的检测比浩源系统更加全面。在成本上，浩源系统低于罗氏系统。浩源系统检测通量也略大于罗氏系统，更适合大规模血液标本的筛查。本实验室为两套NAT系统交替使用，间隔期间备用实验室仍应加强定期的清洁消毒及室内污染监测；仪器需定期开机运行、维护及校准；试剂需存放在合适温度的医用冰箱内；工作人员需定期巡视查看实验室及冰箱温度、湿度，并做好相应记录。工作人员还需每月对各套NAT系统的性能指标进行统计分析，既可以进行同一系统内的同期比较，也可以进行不同系统间的平行比较，对检测系统中可能出现的误差及早发现，并组织工作人员进行检测技术和知识的培训学习、经验交流，对工作中出现的不规范操作及时进行纠正，确保检测结果准确、稳定。

病毒酶联免疫吸附试验检测的是病毒的抗原、抗体，病毒从进入人体到产生一定浓度的抗体需要一段时间，所以会有检测的“窗口期”。而病毒核酸检测的是病毒的DNA或RNA，并且有扩增放大效应，即使微量的病毒核酸也能被检测到，可以缩短病毒检测的“窗口期”；静默感染会造成酶联免疫吸附试验的漏检，但对病毒核酸的检测没有影响；酶联免疫吸附试验也有优势，就是抗原、抗体存在时间长，而病毒核酸的存在有间歇现象，所以酶联免疫吸附试验可检测的时效性更长。病毒酶联免疫吸附试验和NAT 法是无法相互替代的，而两者联合应用相互补充，对病毒的漏检率有明显的降低作用[19-20]。

本实验室在日常血液筛查工作中注重检测仪器与试剂的不断升级更新，工作人员也定期进行最新专业技术与知识的培训、工作经验的交流分享，保证实验结果的准确性。