蕨麻猪高原多脏器功能障碍综合征模型eNOS与ET-1的变化研究*

付晓燕 冯小明 李渊明 肖 攀 王红义 陆 璐 张 梅 牛廷献

(1.中国人民解放军联勤保障部队第940医院超声诊断科,兰州 730050)(2.中国农业科学院兰州兽医研究所,兰州 730046)(3.中国人民解放军联勤保障部队第940医院基础医学实验室,兰州 730050)(4.甘肃省中心医院神经内科, 兰州 730070)

多脏器功能障碍综合征(multiple organ dysfunction syndrome, MODS)具有发病急、进展快、病死率高的特点,是危重症患者最重要的死亡原因之一[1]。我国高原地区急性高原病重型并发MODS的发病率较高[2-3]。高原多脏器功能障碍综合征(high altitude multiple organ dysfunction syndrome, H-MODS)虽然在发病机制上与平原的并无差异,但由于以缺氧为主高原环境打击使其发病及病程更为复杂危险[4]。内皮缩血管肽(endothelin, ET-1)和一氧化氮(nitiric oxide,NO)是维持血管舒缩功能、共同保持血管的正常状态和功能的重要活性物质,在正常情况下处于动态平衡[5]。ET-1是人体作用最强的血管收缩剂,主要由血管内皮细胞合成和分泌,它具有刺激血管平滑肌细胞增殖的作用[6-7]。NO是机体内自由扩散的一种信号分子,它具有调节血管舒张度,并抑制血小板聚集和白细胞黏附,它是炎性反应中的关键介质,起到保护内皮细胞的作用,一氧化氮合成酶(eNOS)是NO合成的限速酶,其活性的改变将影响NO的生成[8-9]。深入认识 ET-1 和 NO 的平衡对人体微环境的调节及炎性反应过程中的变化特点,也将有助于揭示H-MODS在炎性反应过程中的变化特点,这将有助于对H-MODS的诊断及精准用药,提高对H-MODS病程发展及致病机制的认识,从而拓宽临床诊治H-MODS的思路和治疗水平。

1 材料和方法

1.1 材料

动物与试剂:蕨麻猪24只,雌雄各半,体质量15 kg左右,分为H-MODS蕨麻猪模型高、中、低剂量组和对照组,每组6只,按雌雄各半随机分组。蕨麻猪为甘南地区散户饲养。eNOS与ET-1试剂盒(武汉华美)。氯胺酮(国药准字:H35020148,福建古田药业有限公司),地西泮注射液(国药准字:H12020957,天津金耀氨基酸有限公司),内毒素(LPS)(血清型为:O127:B8,批号为64H4010,Sigma公司)。

1.2 方法

1.2.1模型建立方法:建模方法参照文献[10-11],本实验在海拔3 500 m的甘南桑科草原进行,将猪运到实验地点适应性饲养3 d,待动物状态稳定后进行实验。动物麻醉采用氯胺酮(6 mg/kg)联合安定(0.5 mg/kg)进行肌注麻醉,同时肌肉注射阿托品(0.05 mg/kg)。动物麻醉后经耳缘静脉泵入脂多糖(lipopolysaccharides, LPS),每组泵入时间均控制在30 min左右,低、中、高剂量组分别按0.25 mg/kg(B组)、0.35 mg/kg(C组)、0.5 mg/kg(D组),对照组(A组)以等量的0.9%氯化钠溶液代替。

1.2.2MODS的诊断标准:按参照文献[10]提出的动物发生MODS时各个器官功能障碍分期诊断标准和评分标准。在注射LPS后出现2个或2个以上器官或系统功能障碍判定为MODS。

1.2.3血清采集:3组分别于泵入LPS后0、3、6、12、24、48 和72 h经颈静脉采血,分离血清存于-80 ℃待检测。

1.2.4ELISA检测指标:eNOS与ET-1表达水平由本实验室参照试剂盒操作说明进行检测。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 模型建立结果

中、高、低各剂量组猪经麻醉输入LPS 1 h后,各组猪均有倒卧昏睡状态,并心率增快,伴随有腹胀、发热、尿频;苏醒后四肢无力倒卧,食欲减退,精神萎靡,呼吸急促等表现。低、中剂量组猪1 h后转醒,在8 h后站立行走,开始采食,精神基本恢复正常;高剂量组在2 h后才慢慢开始转醒,站立行走时间要比低、中剂量组晚2 h;中剂量组1头猪在4 h时发生呼吸窘迫、心律失常,继之心脏衰竭死亡。高剂量组猪在3 和5 h时各有1只猪发生呼吸窘迫、心律失常,继之心脏衰竭死亡。低剂量组猪没有出现死亡,对照组猪体征表现正常,也无死亡。中剂量组与高剂量组猪死亡率分别为16.7 %和33.3 %。通过研究发现,中、高剂量组猪均出现死亡,都可以成功建立H-MODS模型[12]。

2.2 eNOS的变化

蕨麻猪静脉泵入LPS后,B、C、D组eNOS表达量变化趋势基本相同,在3 h骤然升至峰值,之后快速下降,至24 h基本恢复到正常值,对照组表达量平稳,无显著性变化。B、C、D组eNOS表达量在3～12 h与0 h和A组相比明显升高(P<0.01);24～72 h B、C、D组eNOS表达量基本恢复到正常值,与0 h和A组相比无明显差异。eNOS表达量情况与走势详见表1。

表1 各组猪不同时点eNOS的表达量比较

2.3 ET-1的变化

蕨麻猪静脉泵入LPS后,B、C、D组ET-1表达量变化趋势大致相同,都是在泵入LPS后急剧上升,在3 h升至峰值,之后开始下降,至24 h基本恢复到正常值,对照组表达量在各时间点无显著性变化。B、C、D组ET-1表达量在3～6 h与0 h和A组相比显著升高(P<0.01);B、C组ET-1表达量在12与0 h和A组相比明显升高(P<0.05);D组ET-1表达量在12 h与A组相比明显升高(P<0.05);24～72 h B、C、D组ET-1表达量基本恢复到正常值,与0 h和A组相比无明显差异。ET-1表达量情况与走势详见表2。

表2 各组猪不同时间点ET-1的表达量比较

3 讨论

蕨麻小型猪又名合作猪,主要分布在海拔3 000米以上甘肃省甘南藏族自治州,是高原高寒农牧区通过放牧采食进行饲养的原始地方小型猪种,具有极强的适应高原环境的特性[13],作为一种具有高原特性的小型猪尤其适合作为高原疾病模型H-MODS的建立[14]。本研究利用LPS诱导蕨麻猪成功建立H-MODS模型,对蕨麻猪发生MODS时的ET-1和eNOS表达情况进行检测,研究两者在H-MODS发生发展中的变化特点及作用。

ET-1和NO是一类具有维持血管舒缩功能的重要活性物质,在正常情况下机体内ET-1和NO处于动态平衡状态,它们共同维持血管的正常功能和状态[15];一旦机体的ET-1轴及NO系统信号通路发生异常,两者平衡关系被打破,这将引起血管内皮功能紊乱和内皮脱落坏死,而内皮下层各种成分暴露将造成血管壁完整结构的破坏,所以它们的平衡促进多种疾病的发生、发展,在血管损伤性疾病中具有非常重要的意义[16]。eNOS是合成NO起主要作用的酶,它在调节血管壁结构和功能中具有重要作用,参与心血管疾病的病理生理过程。ET-1是由内皮细胞释放的由21个氨基酸组成的肽家族,ET-1为主要亚型,是至今发现的最强的缩血管物质。ET-1是器官损伤时机体释放的一个重要细胞因子[17]。

炎性反应是具有血管系统的活体组织对内源性或外源性刺激所做的防御性反应。血管内局部缺氧、血小板聚集、代谢物堆积、单核细胞及巨噬细胞黏附加上机体的炎性反应可以导致血栓及动脉斑块形成、血压升高、微循环障碍、瘤细胞侵袭转移等问题发生。NO参与多种炎性信号的传导,可与多种炎性因子相互作用,它既是免疫调节和炎性反应的调节因子,也是重要的效应因子[18]。本研究中蕨麻猪经LPS诱导发生多脏器炎性反应后,其eNOS及ET-1表达量均在3 h达到最大,之后开始降低,到24 h已经恢复正常,由此可以看出在LPS诱导蕨麻猪形成高原MODS时体内迅速出现炎信反应,伴随着机体炎性反应迅猛发生,免疫应急反应随后即可启动,通过免疫调节作用最终炎性反应得到抑制而达到体内环境的平衡稳定。两者变化呈现典型的抛物线形变化趋势,这种变化趋势也使得机体不会出现过度抗炎性反应及免疫功能抑制,使得机体在MODS发生炎性反应时及时得到调整最后维持机体的平衡。

另有研究显示,在高原MODS发生发展过程中,炎性及免疫反应贯穿整个疾病的发展始末,促炎细胞因子与抗炎细胞因子之间伴随着免疫反应调节最终取得平衡以达到内环境的稳定,其TNF-α及IL-1β炎性指标变化也呈现迅速的抛物线形变化趋势[19]。H-MODS的发生加入了缺氧的打击因素,而缺氧会激活eNOS产生NO从而刺激机体生成大量的氧自由基,过多释放氧自由基使细胞膜的结构和功能受到损伤,引发脂质过氧化作用并形成过氧化产物,并进一步通过联级放大效应扩大活性氧的作用,最终导致机体的细胞代谢和功能产生障碍。LPS致蕨麻猪形成MODS 时导致eNOS水平的变化,而NO 表达水平的高低对机体组织结构与功能具有重要的影响,NO是炎性介质瀑布样连锁反应的最终介质之一,它既参与机体炎性反应,又介导以CARS为主要特征的免疫功能低下,增加机体的感染风险,因此eNOS表达水平与MODS的发生发展密切相关[20-21]。有研究[22]发现LPS致大鼠形成MODS时,eNOS表达量也显著增加,这表明NO 水平与MODS病情发展具有一定的相关性。此外,NO可通过舒张血管作用造成持续性低血压容易形成微循环淤血,从而引起组织细胞的缺血、缺氧损伤产出大量自由基,这些损伤共同造成组织细胞破坏形成MODS。

综上所述,高原MODS发生发展过程中ET-1和eNOS变化息息相关,它们无疑也是高原MODS病程发展的表征因子,同时进一步认识高原MODS致病特点,为高原MODS致病机制的研究提供理论依据。