热应激对ICR雌性小鼠血液生化指标的影响*

田永路 李夏莹 韦玉生 李 娜 曹 栋 朱德生

(1.北京大学心理与认知科学学院,北京 100871)(2.北京大学IDG麦戈文脑科学研究所,北京 100871)(3.北京大学实验动物中心,北京 100871)

当动物处于适宜温度范围以外的环境中时,会导致动物生产性能下降,死亡率升高,繁殖能力下降,从而造成巨大的经济损失[1]。有相关资料报道,不采取任何防暑方法的情况下,畜牧业所遭受的经济损失多达24 亿美元[2-3]。而有效的防暑降温措施可以挽回每年至少7亿美元的经济损失[2,4]。因此,热应激对畜牧业的发展影响巨大。而在实验动物方面,国家标准GB 14922—2001[5-6]中取消了普通级大、小鼠,要求所有的大、小鼠必须在清洁级以上条件下生产。最新修订的GB 14922—2022[7]中取消了清洁级大、小鼠,目前大、小鼠只有无特定病原体级(SPF级)和无菌级。所有动物要求饲养在屏障和隔离环境内,在满足动物最大生理需求的同时,保障了动物福利,更重要的是对于实验结果的可靠性、准确性和重复性也提供了必要的条件支撑。当今世界相互合作已趋于常态化,在科学研究过程中,课题组之间动物的交换时有发生,这就涉及到动物运输的问题,尤其是在一些远距离的跨国和跨省的运输情况下,即使我们使用标准的转运笼具,但是动物也会经常受到高温或低温带来的影响,尤其是夏季7、8月份动物的运输,往往导致热应激发生,甚至动物运输过程中大量的死亡[8]。

热应激是指处于高温环境中的机体对于热环境提出的任何要求所做的非特异性的生理反应的总和[9]。动物主要表现为喘气,食欲下降,饮水增加,排汗、排尿增加,代谢旺盛,精神狂躁不安[8,10-11]。导致机体出现一系列神经和内分泌变化,影响体内物质代谢的改变,而神经体液调节和物质代谢都需要通过血液循环系统协同完成各种功能的调控,因此,血液生化指标变化在一定程度上反映热应激时动物机体物质代谢水平和组织器官的机能状态[8]。本实验主要检测了血清电解质Na+、K+和Cl-浓度,血清蛋白的含量以及血清酶的活性,来探讨热应激对于小鼠神经和心血管系统、物质代谢和机体受损程度的影响。

本实验在模拟夏季持续高温条件下,制备小鼠热应激模型。来探索解决长期热应激对动物影响的因素,为未来抗热应激的研究提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1实验动物:4周龄的SPF级ICR小鼠32只,雌性,由北京维通利华实验动物技术有限公司提供【SCXK(京)2021-0006】。实验经北京大学实验动物福利伦理委员会批准,伦理审批号:LAC-ZhuDS-1。动物饲养于北京大学实验动物中心屏障设施内,相对湿度控制在40%～70%,温度控制在22～26 ℃,适应3 d后进行实验。

1.1.2主要仪器及试剂:罗氏全自动生化分析仪及配套试剂(罗氏公司);移液枪【大龙兴创实验仪器(北京)有限公司】;离心机(艾本德股份公司)。

1.2 方法

实验随机分成两组:对照组和热应激组。对照组16只小鼠,放于SPF级饲养室内饲养,室内温度25 ℃,湿度40%～70%;热应激组16只小鼠。每天将热应激组的小鼠全部放入42 ℃(实测温度在41～43 ℃)的生化培养箱中热应激3 h,热应激期间小鼠自由采食和饮水,热应激完成后将小鼠放回饲养室。如此重复4周,期间每周随机取对照组和热应激组小鼠,取样情况见表1。

表1 实验方案(n=4)

在热应激结束后的第7、14、21、28 天收集血液,血液收集采用眼眶静脉丛采血方法进行,置于1.5 mL的离心管中,静置30 min后,4 500 r/min离心10 min。取上清黄色透明液于0.5 mL离心管内,每个时间点各选取4只小鼠进行血液生化指标的测定。血液理化指标包括小鼠血清Na+、K+、Cl-、血清总蛋白(TP)、血清白蛋白(ALB)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、乳酸脱氢酶(LDH)、血清碱性磷酸酶(ALP),采用罗氏全自动生化分析仪进行测定。其中Na+、K+、Cl-采用离子选择电极法;TP采用双缩脲法;SA采用溴甲酚绿法;ALT、AST、LDH、ALP采用速率法。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 热应激对雌性小鼠血清电解质的影响

热应激3 h/d,在第7、14、21 和28天时,动物由于长时间的热应激,对于热应激形成了耐受。导致的排汗、排尿和代谢都受到抑制,使得体液离子浓度变化不明显。由表2可知,长期热应激状态下,小鼠血清中的Na+浓度较对照组偏高,而K+浓度均较对照组偏低,并且各组之间不存在统计学差异。C1-浓度较对照组在第28 天时显著增高(P<0.05)。

表2 血清电解质变化结果

2.2 热应激对雌性小鼠血清蛋白质含量的影响

从表3可以看出,热应激3 h/d,在第7、14、21 和28 天时,应激导致的细胞损伤和代谢异常致使血浆蛋白浓度变化,血清总蛋白含量在各个时期不存在显著差异(P>0.05),而白蛋白的含量在第28 天显著高于对照组(P<0.01)。

表3 血清蛋白质变化结果

2.3 热应激对雌性小鼠血清酶活性的影响

热应激3 h/d,在第7、14、21 和28 天时,热应激组ALT浓度均高于对照组,但是各组之间不存在显著差异(P>0.05)。热应激组AST浓度均高于对照组,在第21天时,热应激组极显著高于对照组(P<0.01);在第28 天时,热应激组显著高于对照组(P<0.05)。热应激组LDH浓度在第7、21、28 天时高于对照组,并且第21天时,显著高于对照组(P<0.05)。在第14 天时,LDH浓度低于对照组。热应激组ALP浓度变化规律与LDH相同(表4)。

表4 血清部分酶活性变化结果

3 讨论

热应激导致机体出现神经调节和内分泌调节的变化,并引发细胞新陈代谢的改变,进一步对血液指标产生重要影响,因此,热应激时动物血液生化指标变化在一定程度上反映了机体物质代谢水平和组织器官的机能状态[8]。K+、Na+和C1-的浓度对于神经和心血管系统的兴奋性有决定性影响[8],从实验结果来看,热应激7、14、21 和28 d,小鼠血清中的Na+浓度较对照组偏高,并且各组之间不存在显著差异。而K+浓度均较对照组偏低。这可能是造成小鼠的精神状态萎靡以及周身组织器官血流异常的原因。

热应激组AST、LDH、ALP浓度在第21 天时显著高于对照组。而热应激组ALT浓度均高于对照组,但是各组之间不存在显著差异。糖代谢中,LDH 是丙酮酸产生乳酸酵解反应的酶,而在糖酵解过程中也是关键酶之一。血清中,伴随无氧酵解的加强,该酶的活性会有一定程度的升高,LDH的升高说明无氧酵解在热应激过程中会有加强[4]。该研究发现,热应激组LDH的活性从第14天开始逐渐升高,并在第21天出现显著差异。然而,ALP的活性与成骨细胞的活性正相关,正常情况下与骨胶原蛋白的形成、骨盐沉积及动物生长发育有关[4,12]。有研究[13]发现肉鸡的生长速度与ALP活性呈负相关,这是高温导致肉鸡生产性能下降的重要因素。课题组的前期研究[14]也发现热应激组小鼠的体质量与对照组相比明显下降,随着热应激时间的增加,小鼠ALP 的活性逐渐下降,与文献报道一致。

本实验过程对于血液的收集采用的是眼眶静脉丛采血的方法,此方法是否对小鼠血液生化指标产生影响。主要取决于操作人员的操作手法和熟练程度。而眼眶静脉丛采血避免了与口腔分泌物的混杂,确保了血样不被污染。从而减少了对血液生化指标的影响。有研究[15]曾报道,拔眼球采血法和舌下静脉采血法对大鼠血液生化指标的影响中显示,两种方法对血液生化和血相指标无明显影响,不存在差异。而眼眶静脉丛采血避免了拔眼球采血所带来的血液样本污染的情况。因此,在采血过程中,抓取虽然也是个应激过程,但是只要熟练的保定小鼠,就不会对血液生化指标产生影响。

本研究以小鼠为模型,研究了长期热应激对于血液生化指标的影响,发现了高温是造成动物生产性能下降和死亡的原因,为未来抗热应激机制以及药物研究提供了有利的动物模型和实验范式。