兔源多杀性巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌和肺炎克雷伯菌多重PCR检测方法的建立*

张 贺 陶坤盛 陈见兴 王豪杰 陈洪岩 王玉娥 夏长友

(中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 兽医生物技术国家重点实验室实验动物与比较医学创新团队,哈尔滨 150069)

随着生命科学研究的快速发展,实验动物已经成为科学研究中不可或缺的基础支撑,而实验兔作为最早使用的实验动物之一,其需求量呈现持续上涨[1-2]。然而,在实验兔集约化和规模化养殖的过程中,存在着病原菌感染的严重威胁,特别是近年来抗生素的限制性使用,使细菌性疾病带来的威胁日趋严重,造成一定的经济损失[3]。兔源多杀性巴氏杆菌(Pasteurellamultocida,Pm),金黄色葡萄球菌(Staphyloccocusaureus,Sa)和肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae,Kp)是引起兔较为严重的传染病病原菌,其中Pm为革兰阴性菌,巴氏杆菌科、巴氏杆菌属,是一种重要的人畜共患病原体,能够引起包括禽霍乱、猪肺疫和猪萎缩性鼻炎以及兔出血性败血症在内的多种实验动物疾病[4]。Sa为革兰阳性菌,属于葡萄球菌属,无鞭毛不产生芽孢,人和畜禽均能感染,兔最为易感,可通过皮肤或黏膜伤口感染,常见症状为乳房炎、脚皮炎和皮下脓肿[5-6]。Kp为革兰阴性菌,是肠杆菌科克雷伯氏菌属中最为重要的一类病原菌,可引起兔的肺炎、腹泻、呼吸道感染等,甚至引起败血病[7-8]。3种病原菌易与其他细菌和病毒发生混合感染,加重疾病,通过临床症状和剖检病变难以准确判定,因此需借助更为灵敏的方法检测[9-10]。基因扩增技术是鉴定细菌最可靠的方法之一,然而我国目前仅有针对兔源巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌和肺炎克雷伯菌的单重或双重PCR检测方法。因此,为实现对3种病原菌的同时快速检测,建立一种兔源多杀性巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌和肺炎克雷伯菌的多重PCR检测方法显得尤为重要。

本研究根据GenBank中登录的Pmkmt1、Sanuc和Kpkh1基因序列保守区域,设计了3对特异性引物,首先确定多重PCR方法的最适退火温度、最佳引物浓度,进一步验证该方法的特异性、敏感性、重复性,最后将该方法与已报道的检测方法同时对临床样品的检测结果进行对比,表明本研究成功建立了一种能够同时检测Pm和Sa以及Kp的多重PCR方法,为兔源多杀性巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌和肺炎克雷伯菌的鉴别检测及分子流行病学调查提供了技术支撑。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1实验材料:兔源多杀性巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌产气荚膜梭菌、鼠伤寒沙门氏菌、铜绿假单胞菌、肺炎链球菌、空肠弯曲杆菌、奇异变形杆菌、禽致病性大肠杆菌、支气管败血波氏杆菌、溶血性曼氏杆菌均由本实验室分离并保存。89份疑似感染多杀性巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌的组织病料采集于不同实验兔养殖基地。

1.1.2试剂与仪器:pMD18-T载体、E.coliDH5α感受态细胞由本实验室保存;2×TaqPCR StarMix【宝日医生物技术(北京)有限公司】;细菌基因组DNA提取试剂盒【天根生化科技(北京)有限公司】;核酸蛋白测定仪 Nano-Drop(赛默飞世尔公司);Eppendorf Master-cycler PCR仪(北京佰鸥创投生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1引物设计与合成:根据GenBank中Pmkmt1基因、Sanuc基因和Kpkh1基因的保守序列,利用Oligo7.0软件设计特异性引物序列,由睿博兴科生物技术有限公司进行合成(表1),合成后的引物稀释至10 μmol/L,并保存于-20 ℃备用。

表1 引物序列

1.2.2单一PCR扩增:分别提取Pm、Sa和Kp的DNA 作为模板,进行温度梯度PCR扩增,反应体系(20 μL):2×TaqPCR StarMix 10 μL,上、下游引物各1 μL(10 μmol/L),模板DNA 1 μL,ddH2O补足至20 μL;反应程序为:95 ℃ 3 min;95 ℃ 30 s、45～60 ℃ 30 s、72 ℃ 35 s,35个循环;72 ℃ 5 min。扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.3重组质粒标准品的构建与鉴定:利用胶回收试剂盒分别回收1.1.2中扩增的目的条带,克隆于pMD18-T载体,构建重组质粒pMD-Pm、pMD-Sa和pMD-Kp,分别转化至E.coliDH5α感受态细胞,选取阳性克隆菌由睿博兴科生物技术有限公司测序。将测序正确的阳性菌扩大培养后采用质粒提取试剂盒分别提取质粒pMD-Pm、pMD-Sa和pMD-Kp,用超微量核酸蛋白分析仪测定其浓度并换算为拷贝数,分别作为多重PCR反应的重组质粒标准品。

1.2.4多重 PCR检测方法的建立及优化:将2.06×1011copies/μL的重组质粒pMD-Pm、1.82×1010copies/μL的重组质粒pMD-Sa和2.32×1010copies/μL的重组质粒pMD-Kp等体积混合后作为模板,利用设计的3对特异性引物,采用控制变量法,确定各引物最适浓度。反应体系(20 μL):2×TaqPCR StarMix10 μL,引物kmt1-F/kmt1-R、nuc-F/nuc-R和kh1-F/kh1-R 各1 μL(10 μmol/L),模板1 μL,用 ddH2O 补充至20 μL,同时以ddH2O代替模板作为阴性对照。进一步采用温度梯度PCR法确定适宜退火温度(45～60 ℃),扩增程序为:95 ℃ 3 min;95 ℃ 30 s、45～60 ℃ 30 s、72 ℃ 35 s,共35个循环;72 ℃ 5 min。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.5特异性实验:提取Pm、Sa、Kp、兔源支气管败血波氏杆菌、产气荚膜梭菌等12种病原的DNA并测定浓度,随即将所有待检DNA浓度调整为50 ng/μL后作为模板。同时设立以重组质粒pMD-Pm、pMD-Sa和pMD-Kp混合物为模板的阳性对照及ddH2O阴性对照,利用优化的多重PCR检测方法,评估其特异性。

1.2.6敏感性实验:将2.06×1011copies/μL的重组质粒pMD-Pm、1.82×1010copies/μL的重组质粒pMD-Sa和2.32×1010copies/μL的重组质粒pMD-Kp,分别用ddH2O进行10倍倍比稀释(101～1010)且等体积混合后作为模板,利用优化的多重PCR进行检测,验证该方法的敏感性。

1.2.7重复性实验:应用建立的多重PCR进行重复性实验,批内实验:以pMD-Pm、pMD-Sa和pMD-Kp为模板进行PCR扩增,每次实验做3次重复;批间实验:分批提取质粒pMD-Pm、pMD-Sa和pMD-Kp等体积混合后,在相同条件下分别进行3次PCR扩增,以评估该方法的重复性和可靠性。

1.2.8临床样品检测:将89份来自不同实验动物兔养殖基地病死兔的肺样品,按照1∶10 的体积比加入灭菌 PBS 进行研磨,将研磨后的病料经1 000 r/min 离心 5 min,取上清。按照血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒说明书提取核酸;然后利用本实验建立的多重 PCR 方法进行检测,同时参阅文献根据已报道的检测方法合成引物,进行共同检测并进行比较[7,11-12],计算两种检测方法的复合率。

2 结果

2.1 重组质粒标准品的鉴定

分别以kmt1-F/kmt1-R、nuc-F/nuc-R、kh1-F/kh1-R为引物,扩增Pm的kmt1基因、Sa的nuc基因以及Kp的kh1基因的部分片段,大小分别为335、547 和208 bp,与预期一致,将扩增片段克隆至pMD18-T载体,构建的重组质粒标准品pMD-Pm、pMD-Sa、pMD-Kp。经PCR和测序鉴定,结果显示重组质粒构建成功。采用超微量核酸蛋白分析仪测定pMD-Pm、pMD-Sa和pMD-Kp重组质粒浓度,分别为731.70、60.55和73.65 ng/μL,经换算后其拷贝数分别为2.06×1011、1.82×1010和2.32×1010copies/μL,并将质粒分装存放于-20 ℃备用。

2.2 单一及多重PCR检测的建立

分别以kmt1-F/kmt1-R、nuc-F/nuc-R和kh1-F/kh1-R为引物,pMD-Pm/pMD-Sa/pMD-Kp为模板,采用温度梯度PCR法进行Pm、Sa和Kp的单一PCR扩增,结果显示只有Pm、Sa和Kp能够扩增出特异性条带;阴性对照组无扩增条带(图1)。后将目的条带切胶回收后测序,结果与预期结果一致,表明建立的多重PCR可以同时扩增Pm、Sa和Kp的目的条带。

M:DL2000 DNAMarker;1.单一PCR扩增nuc基因保守区;2.单一PCR扩增kmt1基因保守区;3.kh1基因保守区单一PCR扩增;4.多重PCR扩增;5:水对照

2.3 多重PCR检测方法的优化

通过对退火温度和引物浓度进行优化,确定多重PCR的最佳反应体系(20 μL):2×TaqPCR StarMix 10 μL,kmt1-F/kmt1-R各1 μL(10 μmol/L),nuc-F/nuc-R各1 μL(10 μmol/L),kh1-F/kh1-R各0.5 μL(10 μmol/L),模板pMD-Pm和pMD-Sa各1 μL,pMD-Kp 0.5 μL,ddH2O补足至20 μL;最佳反应条件为:95 ℃ 3 min;95 ℃ 30 s、54.5 ℃ 30 s、72 ℃ 35 s,35个循环;72 ℃ 35 s。结果表明,利用优化后的多重PCR反应体系和条件进行扩增,可同时且清晰的扩增出约335、547 和208 bp的目的条带(图2)。

注:A.多重PCR退火温度;M:DL2000 DNA Marker;1～8.退火温度分别为45.0、46.0、48.0、50.8、54.5、57.5、59.1、60 ℃;B.选择多种PCR引物浓度;M:DL2000 DNA Marker;1～3.Kp引物浓度为1 μmol/L, Pm和Sa引物浓度分别为1、0.75和0.5 μmol/L;4～6.Kp引物浓度为0.75 μmol/L,Pm和Sa引物浓度分别为1、0.75和0.5 μmol/L;7～9.Kp引物浓度为0.5 μmol/L, Pm和Sa引物浓度分别为1、0.75和0.5 μmol/L;

2.4 特异性实验

利用已优化的多重PCR方法,对各病原菌的DNA进行检测,结果显示:只有Pm的335 bp片段、Sa的547 bp片段和Kp的208 bp片段能扩增出目的条带,而其他病原基因组以及阴性对照均无特异性条带,表明该方法特异性强(图3)。

注:M.DL2000 DNA Marker;1.金黄色葡萄球菌;2.兔源多杀性巴氏杆菌;3.肺炎克雷伯菌;4.产气荚膜梭菌;5.鼠伤寒沙门菌;6.铜绿假单胞菌;7.肺炎链球菌;8.空肠弯曲杆菌;9.变形菌;10.禽致病性大肠杆菌;11.支气管杆菌;12.溶血曼海姆症;13.水

2.5 敏感性实验

将2.06×1011copies/μL的重组质粒pMD-Pm、1.82×1010copies/μL的重组质粒pMD-Sa和2.32×1010copies/μL的重组质粒pMD-Kp分别进行等体积混合后10倍倍比稀释作为模板。结果显示,pMD-Pm的检测下限是20.6 copies/μL,pMD-Sa 检测下限是18.2 copies/μL,pMD-Kp 检测下限是23.2 copies/μL(图4),表明该方法敏感性较高。

注:M.DL 2000 bp Marker;1～8.分别为1×107～1×100 copies/μL的混合重组质粒;9.水

2.6 重复性实验

利用建立的多重PCR检测方法进行批内和批间重复性实验,结果显示该方法扩增条带均一致(图5),表明该多重PCR方法具有良好的重复性。

图5 多重PCR的批内(1～3)及批间(4～6)实验

2.7 临床样品检测

利用本实验建立的多重PCR 方法与已报道文献中单重PCR检测方法中所使用的引物分别对 89 份疑似感染样品进行检测,结果显示,Pm、Sa 和 Kp 的阳性率分别为62.92%、25.84%和 49.43%,Pm 与 Sa 混合感染阳性率为 37.08%,Pm 与Kp 混合感染阳性率为 19.10%,Sa 和 Kp 的阳性率分别为 16.85%,Pm、Sa 和 Kp 混合感染阳性率为 12.36%,与这3种病原已报道的PCR 检测方法的检测结果复合率为 100%。表明本研究建立的多重 PCR 方法准确性高,临床应用性好(表2)。

表2 临床样品检测结果(%)

3 讨论

随着生命科学在我国的快速发展,实验兔的需求量日益增长,病原菌的传播对其产生的危害进一步得到重视。兔多杀性巴氏杆菌病、金黄色葡萄球菌病和肺炎克雷伯菌病是危害实验兔最为严重的3种传染病之一,对实验兔的养殖造成严重经济损失[13-14]。其中兔多杀性巴氏杆菌病和肺炎克雷伯菌病为条件性致病菌,能引起兔的呼吸道疾病和败血病等,金黄色葡萄球菌病为引起兔败血症的主要病原菌,3种病原菌具有相似的临床症状,很难通过病理剖检和简单的染色镜检来区分,并且易于其他病原菌发生混合感染和继发感染,给实验兔的养殖产业造成严重的经济损失[15]。目前,虽然已经有针对Pm、Sa和Kp的诊断方法,如参考文献[16]建立的环介导等温扩增技术(LAMP)检测Pm的方法,该方法虽然具有简单易行、特异性高的优点,但是假阳性率较高,并且易受污染。有研究[17-18]采用免疫学原理建立的ELISA方法进行检测Sa,虽然具有操作简单,灵敏性好的特点,但是也不可避免地存在检测费时,成本较高的缺陷。有研究[7,11-12]建立的分别针对Pm、Sa和Kp的实时荧光定量PCR的方法虽具有简化步骤,交叉污染小的优点,但同时也存在假阴性的局限性。另外,与普通PCR相比,该方法的实验条件要求高,价格昂贵。相比之下,普通PCR具有操作简单、价格便宜和实验条件要求低的优点,目前还没有关于此3种病原菌的多重PCR检测方法的报道,因此,建立一种操作便捷、特异性强、敏感性高、可实现同时检测Pm、Sa和Kp的多重PCR检测技术极为重要。

本研究针对Pmkmt1基因、Sanuc基因和Kpkh1基因保守区域设计并筛选出3对特异性引物,通过优化反应条件,建立了可以同时检测Pm、Sa和Kp的多重PCR方法。该方法特异性强,仅对Pm、Sa和Kp有特异性扩增片段,而对兔源支气管败血波氏杆菌、产气荚膜梭菌等9种病原体均无扩增条带。并且其敏感性高,对pMD-Pm的检测下限是20.6 copies/μL,pMD-Sa的检测下限是18.2 copies/μL,pMD-Kp的检测下限是23.2 copies/μL。此外,批内和批间实验结果均一致,表明本方法具有良好的重复性和稳定性。通过对疑似感染Pm、Sa和Kp的样品进行检测,结果显示Pm、Sa和Kp阳性率分别为62.92%、25.84%和49.43%,Pm、Sa和Kp的混合感染阳性率为12.36%,与已报道的检测方法符合率100%,表明本研究建立的多重PCR方法准确性高,在临床诊断中具有良好的应用价值。

综上所述,本研究针对Pm、Sa和Kp 3种严重危害实验兔养殖建立的多重PCR方法特异性强、敏感性高、稳定性好、效率高,可用于实验兔的生产过程中疑似兔感染多杀性巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌和肺炎克雷伯菌的快速鉴别诊断,为预防实验兔的多杀性巴氏杆菌病、金黄色葡萄球菌病和肺炎克雷伯菌病提供有力的技术支持,具有广阔的应用前景。