拐枣活性成分及其提取技术研究进展

杨子悦，林 洁，霍 蕾，刘丹阳，朱新鹏

（安康学院现代农业与生物科技学院，陕西 安康 725000）

拐枣（Hovenia acerba），又名枳椇、鸡脚爪、万字果、万寿果、金钩子、鸡爪梨等，其可食部分是肉质肥大的果柄（果梗）［1］。拐枣在中国分布广泛，主要分布在陕西、四川、重庆、湖北、湖南、江西、江苏、浙江、福建、广东、安徽、河北、河南等地，以陕、川、渝量多质佳［2］，生长于海拔2 100 m 以下地区，喜温暖湿润气候，对土壤质地要求不高，适应性较强，产量高。拐枣虽然味甜，但因其形状多分支且扭曲不规则、比表面积大、果皮多，不便鲜食，民间多用于酿酒、制醋，鲜食量很少。拐枣含有酚类、多糖、皂苷、生物碱等生物活性成分，具有抗氧化、解酒、保护肝脏、抗糖尿病、保护神经、减肥降脂、抗衰老、抗疲劳、免疫调节和抗肿瘤等作用，是制备具有保健功效食品的良好原料［3，4］，因而具有很高的研究价值。

1 拐枣的主要活性成分

1.1 多酚类物质

多酚类物质是一类含有一种或多种羟基酚的酚类衍生物总称，广泛分布于植物界，具有抗氧化、抑制肿瘤、调节毛细血管、抗炎、增强免疫力、抗衰老等多样生物活性作用，因而广受关注。人体不能合成多酚类物质，需要从食物中摄取。拐枣中多酚类物质是其具有多种生物活性的重要物质基础。倪星等［5，6］比较了不同树龄拐枣果梗的多酚含量，以树龄26～50年的拐枣多酚含量最高，达到15.88 mg/g；在比较不同采摘时间的研究中，以10 月下旬采收拐枣多酚含量最高，达到17.59 mg/g。向进乐等［7］采用Folin-Ciocalteu 比色法测定枳椇果梗总酚含量为1.38%。Han 等［8］初步鉴定了拐枣中有41 种多酚类物质，其中被定量的有5种酚酸和14种黄酮类物质。

黄酮类物质是拐枣多酚类物质的重要组成成分。倪星等［5］采用分光光度法测定树龄21～25 年的拐枣总黄酮含量最高，达到12.53 mg/g。杨航等［9］测定枳椇果梗（拐枣）总黄酮含量为0.871 mg/g。Ma等［10］在拐枣中分离出一种新的黄酮（1，3-二羟基-2-庚烯-4-异戊烯基-5-苯基-11，12-二甲基吡喃黄原酮-10-酮）及6 种已知的黄酮类物质，并证实了其对HepG2 细胞的保肝活性。陈成龙等［11］报道了拐枣中含有柚皮素、芹菜素、槲皮素、山柰酚、杨梅素、没食子儿茶素等黄酮类物质，并阐述了其对糖尿病的核心靶点。杜瑞雪等［12］采用乙酸乙酯从拐枣中萃取4 种多酚物质（柚皮素、杨梅素、二氢杨梅素和槲皮素），初步确证其具有解酒保肝作用的有效成分主要为二氢杨梅素和槲皮素。Yoshikawa 等［13］研究报道拐枣中分离出3 种新的黄酮类物质，分别命名为HovenitinⅠ、HovenitinⅡ和HovenitinⅢ，以及4种已知的黄酮类化合物Ampelopsin、Laricetrin、杨梅素和没食子儿茶素。

酚酸是多酚类物质的另一重要类别，具有抗氧化、抗炎、清除自由基、抗紫外线辐射、抑菌及增强免疫力等生理活性。向进乐等［14］采用酸碱水解、有机溶剂萃取的方法从拐枣中分离制备游离酚酸（SFPA）、酯型酚酸（SEPA）、糖苷型酚酸（SGPA）、不溶性结合型酚酸（ISPA）4 种不同类型酚酸，其中ISPA 含量显著高于其他3 种酚酸，ISPA 也表现出最强的抗氧化活性。

1.2 多糖

多糖是植物中广泛存在的重要活性物质，具有抗氧化、抗菌抗病毒、降血脂、降血糖、增强机体免疫功能等作用。朱炯波等［15］采用蒽酮—硫酸比色法测定拐枣多糖含量为13.83%。倪星等［5，6］研究表明，随着树龄增加，拐枣多糖含量逐渐增多，树龄达200～300 年多糖含量可达9.52%，而树龄5～10 年则仅为3.4%，且在11 月初采收含量最高。Liu 等［16］用DETE-纤维素阴离子交换色谱和葡聚糖凝胶过滤色谱分离纯化拐枣粗多糖，用高效凝胶色谱法鉴定分离出3 个多糖组分分子量，分别为234.75、69.72、52.50 kDa，均为酸性多糖，由阿拉伯糖、鼠李糖、葡萄糖和半乳糖组成。Wang 等［17］通过离子交换层析和凝胶过滤层析对提取的拐枣粗多糖进行逐级纯化，制备了3 个纯化组分，均为杂多糖，主要由鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖和半乳糖醛酸组成，平均分子量分别为235、70、53 kDa；进行体外免疫刺激活性评价表明，拐枣多糖具有较强的免疫刺激活性，可作为潜在的天然免疫调节剂。Liu 等［18］分离出的拐枣杂多糖平均分子量约为4 570 kDa，主要由鼠李糖、岩藻糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖组成，具有良好的抗氧化能力和增强乙醇脱氢酶活性的能力。Yang 等［19］对拐枣多糖进行分离纯化，采用DEAE-52 阴离子交换柱层析得到HDPs-1、HDPs-2、HDPs-3 3 个组分；HDPs-2 再用Sephadex G-100 柱层析，得到单一组分HDPs-2A，其平均分子量为372.91 kDa，单糖组成主要包括甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖等，并证明了HDPs-2A 对2 型糖尿病有良好的治疗作用。

1.3 皂苷类物质

皂苷具有调节脂质代谢、降低胆固醇、抗菌、抗血栓、抗氧化、镇痛、抑制肿瘤和免疫调节等作用，可分为甾体皂苷和三萜皂苷两大类。已报道的拐枣皂苷主要是三萜皂苷，以拐枣的叶、根皮和种子报道较多。拐枣果梗中分离的有Hovenic acid、Hovetrichoside H、Hceanothetric acid 和Hovenidulciosides A1、A2、B1、B2，这些三萜皂苷类物质具有抑制组胺释放的作用［20-22］。兰光等［23］报道枳椇果梗总皂苷含量为4.975%，为拐枣叶子、枝干、果梗、果渣、种子、种壳中最高的部位。

1.4 生物碱

生物碱是一类含氮碱性有机化合物，在植物中分布广泛。有的生物碱具有抗菌消炎、降血压、解热、镇痛等作用。Makoto 等［24］从枳椇的根皮中，用制备薄层色谱法分离鉴定了异欧鼠李碱（Fangulonine）、枳椇碱A（Hovenine A）和枳椇碱B（Hovenine B）3 种肽类生物碱。倪星等［6］测定拐枣生物碱含量在第4 次（11 月上旬）采摘时最高，为0.22%，在第2次（10 月下旬）和第7 次（11 月下旬）采摘时最低，为0.17%，基本保持稳定。兰光等［23］报道枳椇果梗总生物碱含量为1.020%，是拐枣叶子、枝干、果梗、果渣、种子、种壳中最高的部位。

1.5 膳食纤维

膳食纤维是植物中不被人体消化的一大类碳水化合物，主要包括纤维素、木质素、抗性低聚糖、抗性淀粉、果胶等。膳食纤维具有维护肠道健康、调节血糖、预防2 型糖尿病、增加饱腹感、调节体重、预防脂质代谢紊乱、预防便秘、预防某些癌症等作用，越来越受到关注。江庆中等［25］报道拐枣中粗纤维含量为4.88%，果胶含量为2.28%。Bampi 等［26］测定巴西拐枣的膳食纤维含量为12.56%。

2 拐枣活性成分提取技术

2.1 拐枣多酚类物质的提取技术

2.1.1 拐枣黄酮类物质的提取 黄酮类物质因具有多种生物活性作用而被高度关注，黄酮类物质分离提取是拐枣研究热点之一。张存莉等［27］2008 年申请的专利，公开了采用溶剂提取法与溶剂萃取法、大孔吸附树脂法、超临界流体萃取法、柱色谱法和液-液逆流分配色谱法中任意一种方法或这些方法的任意组合，对北枳椇果柄、果实、种子、种壳、叶、花、根、茎、枝、皮和果渣等任一部位或其组合进行提取、分离和纯化的方法；制备的总黄酮为含两种或两种以上黄酮类活性成分的组合，其中最主要的活性成分是槲皮素、山萘酚、杨梅素、（+）-二氢杨梅衍生物等。其后，拐枣黄酮类物质分离提取研究报道逐渐增多，从分离方法来看，主要以乙醇溶液为溶剂，再以微波或超声波辅助提取分离。

采用乙醇溶液为溶剂提取拐枣总黄酮，乙醇浓度在50%～75%。许洪波等［28］优化的拐枣总黄酮最佳提取条件为料液比1∶50（g/mL）、提取时间1.85 h、乙醇浓度53.0%，平均提取率可达2.56%。赵婷等［29］研究的提取工艺为拐枣12 倍量、60%乙醇回流提取2 h。杨航等［9］研究提出的总黄酮提取条件为乙醇浓度75%，料液比1∶50（g/mL），提取时间9 h。马丽等［30］研究表明乙醇热回流提取拐枣总黄酮后，中极和极性的大孔树脂对拐枣总黄酮的富集优于非极性及氢键吸附型的树脂，其中HPD400 大孔树脂对拐枣总黄酮的富集效果最好。

微波常被用于植物有效成分的辅助提取，具有选择性高、溶剂用量少、提取时间短、得率高等优点。梅鑫东等［31］的研究提出拐枣在微波功率840 W、乙醇水溶液浓度52%、萃取时间54 s、料液比1∶9.4（g/mL）、浸泡时间1 h 和颗粒粒径2.5×10-4m时，总黄酮萃取率为98.05%。

超声波具有机械效应、空化效应和热效应等作用，能促进有效成分的溶解，是一种常用于有效成分提取的辅助方法。朱新鹏等［32］采用超声波辅助提取拐枣总黄酮，提取的工艺条件是乙醇体积分数50%、料液比1∶50（g/mL）、提取温度55 ℃、超声波功率300 W、提取时间60 min，总黄酮提取率为3.60%±0.03%。

2.1.2 拐枣其他多酚类物质的提取 有关拐枣中其他多酚类物质分离提取的报道较少，主要在进行其他多酚研究目的中用到多酚的提取方法。李伟青等［33］在研究拐枣抗氧化活性时，采用85%的乙醇提取3 次，然后在减压条件下回收至无乙醇味，所得乙醇提取物用水混悬后依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇等体积萃取4 次，再测定其中的多酚含量。其中乙酸乙酯提取物中酚类物质含量最高，相当于45 μg/mL 一水合没食子酸，正丁醇提取物次之，为29 μg/mL，石油醚提取物为21 μg/mL，而乙醇提取物仅为16 μg/mL，水层提取物最少，为13 μg/mL。郑朋朋等［34］用体积分数为80%的乙醇溶液浸提物对拐枣子、拐枣和拐枣枝进行抗氧化性比较，并用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、甲醇进一步萃取拐枣的乙醇提取物，结果乙酸乙酯萃取物的抗氧化能力最强，其多酚含量达到202.8 mg/g。向进乐等［7］在研究枳椇果梗多酚含量时，采用70%甲醇溶液，40 ℃超声提取30 min，然后测定多酚含量。向进乐等［35］在另一枳椇果梗不同极性多酚研究中，不同溶剂萃取枳椇果梗多酚含量和抗氧化活性强弱次序为水相、正丁醇相、乙酸乙酯相、氯仿相，且多酚以极性酚为主。上述结果说明，乙酸乙酯、正丁醇、石油醚、甲醇等均能用于拐枣多酚的提取。

向进乐等［14］在拐枣中不同类型酚酸含量的测定研究中，采用80%甲醇在30 ℃下超声提取30 min。提取液经过不同处理，分别得到拐枣果梗游离酚酸、可溶性酯型酚酸、可溶性糖苷型酚酸和不溶性结合型酚酸。

2.2 拐枣多糖的提取技术

多糖是拐枣含量较高的一类活性物质，提取分离的研究相对较多。报道的提取方法有水提取法、超声波辅助提取法、酶提取法、反复冻融-回流提取法等。

水提取法需在提取前进行脱脂、脱单糖处理，得到的水提取多糖，再用有机溶剂除去蛋白质等杂质。朱炯波等［15］较早采用脱脂和脱单糖后的拐枣粉，用沸水回流提取拐枣多糖，再用有机溶剂除去蛋白质等杂质，得率为13.08%。魏丕伟等［36］采用石油醚脱脂、80%乙醇除单糖后，优化的提取条件为温度80 ℃，料液比1∶15（g/mL），回流提取2 次，每次2 h，得到的拐枣多糖含量为10.288 mg/g。再经除杂，冷冻干燥后得到精制多糖，得率为62.818%。刘旭东等［37］采用石油醚回流脱脂后，优化得到的水提取条件为料液比1∶25（g/mL），提取温度85 ℃，提取时间1 h，醇沉体积分数80%，多糖得率为3.06%±0.181%。蔡冰洁等［38］用料液比1∶30 的沸水浸提2 h，纱布过滤收集上清液，连续提取2 次。上清液用8 000 r/min 离心除去不溶物，再减压浓缩，用95%乙醇处理，再用Sevage 试剂除去蛋白质得到拐枣多糖。汪名春［39］采用75%乙醇，在70 ℃条件下反复3次脱去单糖、色素等小分子物质，优化的水提取条件为料液比1∶21（g/mL），温度96 ℃，时间200 min，提取3 次，拐枣多糖得率为10.47%。

超声波也被用于拐枣多糖的辅助提取。Liu等［16］优化的提取条件为提取温度60 ℃，超声波功率362 W，提取时间65 min，粗多糖的得率为（25.12±0.145）mg/g。杨海涛等［40］用优化的超声波辅助提取条件为提取温度60 ℃，料液比1∶30（g/mL），提取时间20 min，超声波功率320 W，pH 6 缓冲溶液，拐枣多糖的提取率为36.85%。魏丕伟等［41］以蒸馏水为提取溶剂，优化的提取工艺为超声波功率500 W，温度70 ℃，料液比1∶35，提取时间0.5 h，提取2 次，得到的多糖含量为27. 949 mg/g，得率为30. 83%。魏丕伟等［42］还研究了超声-微波联合辅助提取拐枣多糖，优化的工艺条件为超声波功率500 W、微波功率300 W、提取时间15 min、料液比1∶15（g/mL），拐枣多糖得率为67%。Yang 等［43］比较了单频（SF）、双频（DF）和三频（TF）超声波提取拐枣多糖的效果，SF超声波具有更优异的抗氧化活性，优化的DF 超声提取条件为温度58 ℃，时间33 min，超声频率28 kHz和40 kHz，提取率为9.02%±0.29%。

杨兵［44］将经过预处理的拐枣分别采用水提取法（料液比1∶25 g/mL，温度95 ℃，时间2 h）、超声波辅助提取法（料液比1∶20 g/mL，温度50 ℃，超声波功率300 W，时间35 min）、快速溶剂萃取法（样品与硅藻土以1∶5 质量比混合，置于快速溶剂萃取仪的萃取池，以蒸馏水为溶剂，氮气为加压和尾吹气，提取时间23 min，温度130 ℃，提取2 次）进行对比。试验结果表明，热水提取拐枣多糖得率为6.89%±0.21%，快速溶剂萃取拐枣多糖得率为8.62%±0.29%，超声波辅助提取拐枣多糖得率为7.94%±0.13%，快速溶剂萃取拐枣多糖得率显著高于热水提取和超声波辅助提取多糖得率（P＜0.05）。

叶文斌等［45］采用复合酶（β-葡聚糖酶、纤维素酶、木聚糖酶和果胶酶）法提取拐枣多糖，提出的提取工艺条件为酶解温度50 ℃，酶解浓度0.06 g 和pH 5.0，拐枣多糖的最高含量为19.79%。

杨静等［46］将反复冻融技术整合到回流提取方法中，提出的拐枣多糖提取工艺条件为溶胀加水量40 mL/100 g，冻结时间4 h，冻融2 次，解冻温度60 ℃，此时拐枣中的多糖含量为1.68%±0.03%。

2.3 拐枣皂苷的提取技术

兰光等［47］以纯水为溶剂，采用热回流提取法优化拐枣总皂苷的提取工艺为提取温度60 ℃、料液比1∶15（mg/L），提取时间4 h（回流1 次，每次2 h），总皂苷的提取量为16.5 mg/g。其后，又进一步研究拐枣总皂苷的纯化方法，优选LSA-21 大孔树脂，总皂苷的纯度可由原样的6%提升到45%，总皂苷的纯度大幅提升，效果很好［48］。

2.4 拐枣生物碱的提取技术

兰光等［49］用盐酸提取拐枣总生物碱的方法，优化的提取工艺条件为浸渍温度75 ℃，盐酸体积分数6%，时间10 h，固液比1∶15，总生物碱得率为13.8 mg/g。

2.5 拐枣膳食纤维的提取

赵蓓等［50］以磷酸作萃取剂，优化的提取工艺条件为pH 1.0，温度95 ℃，时间3 h，料液比1∶15，果胶得率为2.48%，所得果胶纯度达85.67%。卢忠英等［51］采用纤维素酶法对可溶性膳食纤维进行提取，提取工艺条件为酶解温度60 ℃，酶解时间70 min，pH 5.0，酶用量0.6%，可溶性膳食纤维得率可达14.22%。

3 结语

拐枣在中国有2 000 余年的利用历史，《唐本草》始载拐枣的药用，《本草纲目》《本草衍义补遗》《救荒本草》等均有拐枣的记载。拐枣果梗含有丰富的营养成分和活性物质，兼有食药价值，加之拐枣呈野生状态生长，契合人们对食物天然无污染的要求，具有非常好的开发利用潜力。开展拐枣活性成分提取及利用研究，是高值化开发利用拐枣的前提。因此，进一步研究拐枣活性成分的组成、结构和生物活性作用；开发新型提取与分离纯化技术，选择更为绿色友好、无毒高效的提取分离方法［52］，以及多种活性成分的联合提取是未来拐枣活性成分研究与利用的重点。