土壤砷污染微生物修复研究进展

宋丽新，王宇梅，要 媛，唐彬彬，艾 荣，贺 敏

（包头市疾病预防控制中心，内蒙古 包头 014030）

砷（As）作为普遍存在的一种类金属元素，具有极强的致癌作用，砷元素通过食物链进入人体威胁人类的生命健康。砷通过岩石沉积物和含砷硫化物矿物的氧化释放污染地下水和土壤［1］。据统计，中国约有230 万人受砷污染的威胁，土壤砷浓度超过10 μg/L 的地区总面积为58 万km2，大部分砷污染地区都属于干旱或半干旱地区［2-5］。微生物在自然环境中无处不在，某些微生物可以利用砷化物维持生命［6］。利用微生物在砷污染土壤修复方面的潜力解决被砷污染土壤问题受到众多研究者的关注。

1 砷的危害

土壤中砷的生物有效性、迁移性和毒性取决于土壤中砷结合形态及其分配比例。从化学形态来看，土壤中的砷以无机砷和有机砷的形式存在，无机砷以三价砷［As（Ⅲ）］和五价砷［As（Ⅴ）］为主，有机砷以甲基砷酸盐（MMAs）、二甲基砷酸盐（DMAs）为主。一般而言，有机砷的毒性小于无机砷，五价砷［As（Ⅴ）］的毒性小于三价砷［As（Ⅲ）］［7］。砷化物可经皮肤吸收后进入体内，长期接触砷化物导致慢性砷中毒。无机砷通过抑制酶的活性影响身体和器官的功能，加大动脉粥样硬化、高血压、糖尿病的发病率，诱发皮肤系统、呼吸系统、肝、膀胱、肾等器官系统的癌变［6-8］。此外，急性砷中毒常表现为消化道症状，如恶心、呕吐、腹痛，同时伴有头痛、幻觉、痉挛和昏迷等。严重者呼吸、循环、肝、肾功能衰竭导致休克甚至死亡。

2 土壤砷污染微生物修复

与其他污染物不同，砷会在环境中不断积累无法降解，这主要是因为砷作为类金属物质具有金属的特性，在土壤中需较长时间降解［9］。土壤重金属污染常用的去除方法及各种修复法的优缺点如表1所示。

表1 重金属污染土壤修复方法比较

土壤微生物是地球污染物消纳的净化器。研究表明，微生物利用多种策略来对抗金属的毒性作用，包括减少吸收、外排、细胞外或细胞内隔离或化学修饰［14］。微生物法去除砷通过新陈代谢（包括吸附作用、氧化还原作用、甲基化去甲基化作用）将外部环境中的砷化物作为能量来源，从而促进自身的生长，降低砷的生物毒性［14-18］。大多数报道的除砷微生物是从高砷环境中分离出来的，如水稻种植区，酸性矿山、金矿，砷污染的土壤、湖水或沉积物等，很少是从砷污染较少或不污染的环境中分离出来的。格鲁德夫［19］在研究嗜酸的硫铁氧化杆菌和厌氧的硫酸还原杆菌联合处理含砷污染的土壤时发现，砷由表土层转移到较深亚表层，并形成硫化砷沉淀降低了土壤中砷的含量。真菌在土壤重金属修复中应用也较为广泛，其中曲霉菌和青霉菌对重金属耐受性较强，对如镉（Cd）、砷（As）、铬（Cr）、铅（Pb）等重金属具有良好的吸附效果［20］。王立等［21］将丛枝菌根真菌接种到Cd 污染的水稻田中，有助于提高水稻对镉的耐受性。随着微生物对砷的积累和挥发作用机制的深入研究，其低成本、高环境适应性去除砷的优势被广大研究者应用于土壤重金属污染修复。

3 微生物修复土壤砷污染机制

3.1 吸附作用

微生物吸附砷是一个复杂的过程，简单来讲，肽聚糖、脂多糖、磷壁酸和胞外多糖既是微生物的重要组成成分又是强有力的重金属螯合物质，微生物表面还存在如羧基、氨基、羟基、酰胺基和苯酚类等多种极性官能团，土壤中的砷可与这些物质或官能团结合，减少植物对砷的累积量［22-24］。魏小凡等［25］的研究证明了细菌并非简单地吸附砷，而是利用细胞壁外裸露的官能团与砷发生离子交换、配位结合或络合等化合反应，降低土壤中砷的含量。Maheswari 等［26］从砷污染土壤中分离的构巢曲霉具有吸附污染土壤中砷的能力，在pH 4、温度35 ℃条件下放置11 d 后，土壤中砷的去除率达到84.35%。Yang 等［27］将枯草芽孢杆菌YZ-1 与施氏矿物联合处理砷污染土壤，土壤中总砷的去除率为82.6%。在土壤环境下，利用微生物的吸附作用可将砷“固定”，充分去除As（Ⅲ）或低浓度砷，经济且实效地调控砷污染土壤。

3.2 氧化还原作用

重金属物质化合价的改变影响其毒性大小，经过微生物的氧化或还原之后，对土壤的危害也随之降低［28］。据报道，变形杆菌（Proteus bacteria）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、硫-铁杆菌类（Thiobacillusfer robacillus）、假单孢杆菌（Pseudomonas）具有氧化亚砷酸盐的能力。1994 年，Ahmann 等［29］首次发现能够还原砷的菌并将该菌株命名为MiT-13。经研究表明，大肠杆菌R773 质粒是最早发现的具有砷抗性基因，arsRDABC操纵子与砷耐受有关［30］。金黄色葡萄球菌pI258 质粒含有相似但更简单的arsRBC操纵子，是具有砷酸盐、亚砷酸盐等抗性的质粒［31］。其中，ArsC基因编码砷酸盐还原酶ArsC，该酶能够以砷酸根为电子受体将砷酸盐转化为亚砷酸盐排出细胞外。已发现的砷酸盐还原酶有两大类。一类是以谷胱甘肽和谷氧还蛋白作为电子供体，包括E.coli773 质粒上Ars操纵子中结构基因ArsC编码的蛋白和啤酒酵母第16 号染色体上Acr2P 蛋白［32］。第二类则是以硫氧还蛋白作为电子供体的ArsC 蛋白［33］。Malasarn 等［33］利用分子生物学技术克隆革兰氏阴性菌ANA-3中编码ArrA 的保守基因arrA并进行了测序，证明了arrA为砷酸盐还原酶基因。

细菌可以通过亚砷酸盐氧化酶将亚砷酸根中As（Ⅲ）氧化成As（Ⅴ）砷酸根达到降低砷毒性的目的［34，35］。通过对微生物氧化还原机制在砷污染修复技术的研究，对砷氧化酶有了更多的了解。Santini等［36］第一次在典型的化能自养型砷氧化菌根瘤菌NT-26体内分离获得砷氧化酶，研究发现此酶属于二甲基亚砜还原酶家族，由大小亚基构成四聚体，分别命名为aioA 和aioB ，aioA基因常被用来表征微生物是否具有砷氧化潜力。Valenzuela 等［37］以高砷污染河流沉积物为研究对象，筛选并分离得到耐砷菌。经鉴定该耐砷菌为假单胞菌株，研究发现，砷浓度为0.5 mmol/L 时，该菌株的As（Ⅲ）氧化率达95.6%～100%。利用微生物对某些砷化物的氧化或还原作用，改变土壤中砷的存在状态，可增加土壤肥力，去除砷对土壤的污染。

3.3 甲基化作用

微生物通过转甲基酶（Methyltransferase，ArsM）催化无机砷化合物甲基化，最后形成还原态甲基砷释放到微生物体外。有研究表明，一些微生物代谢甲基基团生成CO2挥发到大气中［38］。此外，在此过程中还可能产生有毒气体砷化氢，但砷化氢不稳定，易被氧化，不会对环境构成危害。沼泽红假单胞菌（Rhodopseudomonas palustris）、梭状芽孢杆菌（Clostridium sp.）、枯草芽孢杆菌和厌氧产甲烷菌（Anaerobic methanogens）具有砷甲基化功能基因arsM［39-41］。枯草芽孢杆菌可在接触亚砷酸盐的48 h内将As（Ⅲ）转化为二甲基胂和三甲基胂氧化物，并挥发大量的二甲基胂和三甲基赖氨酸［41］。Huang等［42］从水稻土中分离出1 株能将As（Ⅲ）全部转化为MMAs并且一半转化为挥发性三甲基胂的菌株。

4 微生物法与其他方法联用技术

微生物修复土壤砷污染具有环境适应能力强、投入成本低且无二次污染的特点，但面对复杂的土壤环境，仅靠单一修复技术都存在不足之处［43］。多手段结合的联合修复技术可发挥取长补短的优势，提高修复效率。在砷污染修复研究中，微生物土壤修复具有环境影响小、适应性强、投入成本低、处理形式多样的特点。微生物法与其他修复技术联合，利用微生物吸附、氧化或还原和甲基化砷的能力，与其他技术结合成为土壤砷污染修复领域的研究发展方向［44］。

4.1 微生物与植物联合修复技术

土壤微生物是维系陆地生态系统地上-地下相互作用的纽带，作为地球生态圈的分解者在植物养分和土壤养分循环两个过程中扮演着不可或缺的角色。早在1999 年，湖南省建立了第一个研究土壤砷污染的植物修复基地，现场修复试验中利用蜈蚣草富集砷的能力达到净化和去除土壤中砷的目的［45］。此外，植物与其共生微生物联合可改变土壤中砷的化学形态，降低砷的生物毒性，促进植物生长。砷污染的水稻土中接种中华根瘤菌属的DWY-1 菌株培育14 d 后，土壤中的总砷降低了32.9%［46］。风车草在CP3 和CP7 菌株联合作用下，对砷的富集率和迁移率分别提高了65%和21%［47］。龙葵在添加淡紫拟青霉菌和绿色木霉菌混合菌液后，不仅提高了对污染土壤中镉和铅的富集能力，而且长势优良［48］。李丹［49］在研究芦苇富集重金属的能力时发现，芦苇在添加微生物后对镉和铅的积累量有所提高。微生物联合植物修复重金属污染土壤技术，充分结合了微生物和植物分布范围较广、材料易得、非侵入性的优点。因此，在砷污染的土壤治理中，结合不同的地质环境筛选适合的微生物-植物组合，能在美化环境的同时，在砷污染土壤的修复治理中发挥更大的作用。

4.2 微生物-化学钝化联用技术

化学钝化是指向土壤中添加化学钝化剂，通过与土壤中砷或其他重金属发生化学反应，生成沉淀或转化为其他存在形式，抑制或降低砷或其他重金属吸收带来的潜在危害。常用的无机钝化剂有磷酸盐、石灰和硅酸盐等，有机钝化剂有秸秆堆肥和畜禽粪便等，可使土壤砷或其他重金属形成难溶性的沉淀，改善土壤理化性状和改良土壤盐碱环境，减缓对土著生物的危害。土壤理化性质的改变直接表现在土壤孔隙度、含水量、pH 以及有机质含量等方面，这些因素能够直接影响土壤中微生物群落结构及酶活性。熊力等［50］研究受砷和镉严重污染的稻田土壤时发现，微生物-化学钝化组合处理的污染稻田土壤中水稻长势优于单纯施用化学钝化剂，表明化学钝化剂在一定程度上提高了微生物的修复能力。Jiang 等［51］利用紫外诱变工程菌、诺沃肥（土豆淀粉、玉米淀粉等原材料的发酵残渣）以及两者的混合物处理受Cd 污染土壤时发现，二者一起添加的修复效果优于单独添加诺沃肥或工程菌。表明诺沃肥能促进工程菌的增殖，大量的工程菌能够吸附固定重金属元素，二者有机结合起到协同作用。朱小娇［52］对比草木灰和工程菌处理Cd 污染小麦田治理效果，研究表明两者联合施用小麦籽粒中Cd 含量更低。化学钝化剂促进具有吸附或转化砷作用的微生物生长，二者协同作用不仅降低土壤中砷的生物毒性，而且能够起到增加土壤肥力的作用。

4.3 生物电化学修复技术

电化学修复技术是指将电极对插入污染土壤中，通过电渗透和电迁移两种机制使重金属离子最终富集在电极区附近或进入电解槽内。微生物燃料电池（Microbial fuel cell，MFCs）则是利用产电细菌作为在分解化合物时释放的电子和质子，将化学能转化为电能的装置［53］。1991 年，英国植物学家Potter［54］首次提出微生物燃料电池这一概念，具有成本投入低、清洁污染小的特点。生物电化学修复技术利用金属离子作为电子受体与产电细菌催化氧化有机污染物释放出的电子结合，产生低毒性或其简单物质的状态，以达到修复生态的目的。Yu 等［55］发现MFCs 可应用于多环芳烃的去除。Hu 等［56］对微生物群落厌氧污泥进行驯化富集，筛选可去除氮杂环化合物底物的COD 值最高达到90.4%的产电菌。Ma 等［57］利用生物刺激和选择性膜联合修复总石油烃（TPH）和镍复合污染土壤，30 d 后土壤中TPH 的降解率为77.4%，镍的去除率为58.5%。Dong等［58］将电动修复与生物降解相结合处理复合污染土壤，经处理后土壤Pb 含量和浓度均达到中国土壤环境质量标准的要求，Pb 和TPH 的去除率达到80%以上。生物电化学修复技术具有二次污染少、绿色清洁的特点，但仅适用于低渗透性、高传导性的土壤，对大规模污染土壤的就地修复技术还处于不断研究和探索阶段。

5 展望

土壤中砷的积蓄严重影响地下水资源和耕地的质量，严重威胁环境和粮食安全。土壤砷污染的修复研究对保护人类舌尖上的安全和生态环境都具有重要意义。研究土壤砷污染的修复机制，有利于现有修复技术的更广泛应用，有利于促进联合修复技术的应用，提高土壤修复效率。联合修复技术虽具有融合其他修复技术的优势，但仍受到重金属种类、浓度及价态等理化性质和环境因素的影响。因此，在砷污染土壤的修复过程中，科学全面的背景考察在选择修复技术时至关重要；同时要充分发挥土著生物的种质优势，实现土壤砷污染的高效治理，保护人类赖以生存的环境。