双步酶法制备鱿鱼加工副产物鲜味酶解液的工艺研究

张修正,梁振鲁,裴继伟,曹燕峰,陈娜,刘海梅,赵芹

(鲁东大学 食品工程学院,山东 烟台,264025)

鱿鱼属头足纲,枪乌贼科软体动物,是一种重要的海洋渔业资源。2020年,我国的鱿鱼远洋捕获量已高达43.28万t,成为全球最大的鱿鱼捕捞国和生产国[1]。目前,国内鱿鱼加工程度普遍不高,加工过程中会产生大量鱿鱼内脏、鱿鱼墨、鱿鱼皮、鱿鱼软骨等副产物,这些副产物大部分直接进行掩埋处理,只有少部分被加工制成饲料或者加工制成鱼粉,产品利用率和附加值低,不仅造成资源浪费,甚至造成环境污染。鱿鱼加工副产物约占鱿鱼体重的20%,其富含蛋白质和呈味核苷酸、氨基酸等,是制备海鲜调味料的良好原料[2]。

蛋白酶水解反应条件温和、安全高效、易于控制,不会产生有毒有害的物质,已成为开发海鲜调味料的关键技术[3-4]。张庆春等[5]通过复配不同蛋白酶的方式制备出呈鲜甜味的南极磷虾酶解液;宿小杰等[6]通过比较不同蛋白酶的酶解效果,以风味蛋白酶制备出鲜味浓郁的红鳍笛鲷鱼排酶解液。但是,酶解工艺也存在2方面问题:一是由于酶解效率不高导致的原料利用不足[7];二是由于蛋白酶酶切导致蛋白质内部肽链中的疏水性基团暴露,使酶解液产生苦味,不仅影响酶解液的整体滋味,也限制了酶解技术在产品开发中的应用[8]。因此,如何选择恰当的酶组合使用,提高水解效率并减少酶解液的苦味是亟需解决的问题。

研究发现,内切酶和外切酶顺序水解可以提高水解效率,降低酶解产物的苦味,提升鲜味[9-10]。碱性蛋白酶属于内切酶,有较多的酶切位点,水解效率高,对芳香族氨基酸、疏水性氨基酸、碱性氨基酸都有较好的水解效果[11]。风味蛋白酶含有内切酶和外切酶2种活性,能较大程度地将暴露在外部的疏水基团降解,同时使一些风味前体物质发生水解,有助于酶解产物形成良好风味[12]。基于此,本研究采用AP200-A碱性蛋白酶和FF106风味蛋白酶对鱿鱼加工副产物进行两步酶解,提升水解度,制备风味良好的鱿鱼鲜味酶解液,以期为鱿鱼加工副产物的高值化利用和海鲜调味料开发提供良好路径。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

材料:鱿鱼加工副产物,龙口佳宝水产食品有限公司,实验室匀浆处理后分存于-18 ℃备用。

试剂:AP-200A碱性蛋白酶、FF106风味蛋白酶(均为食品级),安琪酵母股份有限公司;细胞色素C(标准品),上海甄准生物科技有限公司;抑肽酶(标准品),上海颖心实验室设备有限公司;杆菌肽(标准品),坛墨质检标准物质中心;氧化型谷胱甘肽、还原型谷胱甘肽、L-色氨酸(标准品),北京索莱宝科技有限公司;乙腈、甲醇(色谱纯),科密欧化学试剂有限公司;邻苯二甲酸氢钾、NaOH、无水Na2CO3、K2SO4、硼酸(分析纯),国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

SS250-A型组织捣碎匀浆机,佛山市沃尔姆斯电器有限公司;JRX-20L型曲线升温消化炉,济南精锐分析仪器有限公司;KjeltecTM 8400型全自动凯氏定氮仪,福斯华北京科贸有限公司;L-8900高速氨基酸分析仪,日立(中国)公司;LGJ-18真空冷冻干燥机,北京松源华兴科技发展有限公司;Agilent 1260(四元泵)高效液相色谱仪,安捷伦科技(中国)有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 鱿鱼加工副产物酶解工艺流程

称取一定量的副产物匀浆→加蒸馏水至料液比1∶5→沸水浴加热15 min→冷却至室温→调整适宜pH和温度→加入AP-200A碱性蛋白酶酶解→沸水浴灭酶15 min→冷却至室温→调整适宜pH和温度→加入FF106风味蛋白酶酶解→沸水浴灭酶15 min→冷却至室温→8 000 r/min低温离心15 min→取上清液待测。

1.3.2 AP-200A碱性蛋白酶工艺优化研究

单因素试验设计:改变某一个因素参数,固定其余因素参数,研究酶添加量、酶解时间、pH、酶解温度4个主要因素对酶解工艺的影响。具体单因素试验如下:固定pH为10.0,在55 ℃条件下酶解4 h,研究不同酶添加量(800、1 200、1 600、2 000、2 400 U/g)对水解度的影响;固定酶添加量为2 000 U/g,在pH为8.0,温度55 ℃条件下进行酶解,研究不同酶解时间(4、5、6、7、8、9 h)对水解度的影响;固定酶添加量为2 000 U/g,在50 ℃条件下酶解4 h,研究不同pH值(7.0、7.5、8.0、8.5、9.0)对水解度的影响;固定酶添加量为2 000 U/g,在pH为8.0条件下酶解4 h,研究不同酶解温度(40、45、50、55、60 ℃)对水解度的影响。

正交试验设计:在AP-200A碱性蛋白酶单因素试验的基础上,以酶添加量、酶解时间、pH、酶解温度4个因素为自变量,设计四因素三水平正交优化试验,正交试验水平设计见表1。

表1 AP-200A碱性蛋白酶酶解条件正交因素水平表

1.3.3 FF106风味蛋白酶工艺优化研究

单因素试验设计:改变某一个因素参数,固定其余因素参数,在AP-200A碱性蛋白酶最佳酶解条件的基础上,对FF106风味蛋白酶进行单因素试验。具体单因素试验如下:固定pH为7.0,在55 ℃条件下酶解6 h,研究不同酶添加量(0.50%、0.75%、1.00%、1.25%、1.50%)对水解度的影响;固定酶添加量为1.00%,在pH为7.0,温度55 ℃条件下,研究不同酶解时间(4、5、6、7、8、9 h)对水解度的影响;固定酶添加量为1.00%,在温度55 ℃下酶解6 h,研究不同pH值(6.0、6.5、7.0、7.5、8.0)对水解度的影响;固定酶添加量为1.00%,在pH值为7.0条件下酶解6 h,研究不同酶解温度(40、45、50、55、60 ℃)对水解度的影响。

正交试验设计:在FF106风味蛋白酶单因素试验的基础上,以酶添加量、酶解时间、pH值、酶解温度4个因素为自变量,设计四因素三水平正交优化试验,正交试验水平设计见表2。

表2 FF106风味蛋白酶酶解条件正交因素水平表

1.3.4 水解度测定

采用凯氏定氮法对鱿鱼加工副产物总氮含量进行测定,采用甲醛滴定法对酶解液中游离氨基态氮含量进行测定[13]。具体水解度的计算如公式(1)、公式(2)所示:

(1)

(2)

式中:V,酶解液总体积,mL;V1,滴定样品所消耗NaOH体积,mL;V2,滴定空白所消耗NaOH体积,mL;V3,酶解液甲醛滴定取用量的体积,mL;C,NaOH标准溶液浓度,mol/L;m,酶解鱿鱼加工副产物的质量,g;0.014,与1.00 mL NaOH标准滴定溶液[c(NaOH)=1.000 mol/L]相当的氮的质量,g;AN,酶解液中氨基态氮质量,g;TN,原料中总氮质量,g。

1.3.5 感官评定

选择10名有感官评定经验的评定员(5男5女)进行感官评定,要求评定人员在实验前2 h未进食、吸烟,且单独进行评定。酶解液感官评价标准参考刘丽娜等[14]进行制定,采用9分制对鱿鱼加工副产物酶解液从鲜味、苦味、鱿鱼特征风味3个方面进行感官评定,满分为27分,分数越高则代表酶解液风味越好,具体评价标准如表3所示。

表3 酶解液感官评分标准

1.3.6 游离氨基酸组成分析

参考GB 5009.124—2016《食品安全国家标准 食品中氨基酸的测定》方法进行测定,并分析酶解液中游离氨基酸的滋味活性值(taste active value,TAV),即样品体系中游离氨基酸的浓度与其呈味阈值的比值。根据TAV的大小,可以判断不同游离氨基酸对整体滋味贡献的大小,TAV<1表示游离氨基酸对呈味无贡献,TAV≥1表示游离氨基酸对呈味有贡献,且数值越大,对呈味的贡献越大[15]。

1.3.7 酶解液分子质量分布测定

参考董彩虹等[16]的方法,并略作修改。以细胞色素C(相对分子质量12 365 Da)、抑肽酶(相对分子质量6 511 Da)、杆菌肽(相对分子质量1 450 Da)、氧化型谷胱甘肽(相对分子质量612 Da)、还原型谷胱甘肽(相对分子质量307 Da)、L-色氨酸(相对分子质量204 Da)标准品为标准物质,高效液相色谱法检测不同标准物质的洗脱时间,作相对分子质量对数与洗脱时间的标准曲线。通过比较酶解液中不同组分的洗脱时间计算酶解液的分子质量分布。高效液相色谱条件如下:样品过0.22 μm微孔滤膜,采用TSK-GELG 2 000 SWxl(7.8 mm×300 mm)色谱柱,进样量10 μL,检测温度25 ℃,检测波长220 nm,流速0.5 mL/min,流动相为乙腈∶水∶三氟乙酸=20∶80∶0.1(体积比)。

1.4 数据处理

采用Excel进行曲线绘制与标准偏差分析,采用Origin 9.0绘图,采用SPSS进行方差分析,采用Duncan检验法进行不同水平显著性差异分析,P<0.05为显著,P<0.01为极显著。

2 结果与分析

2.1 AP-200A碱性蛋白酶工艺优化

根据单因素试验,初步确定AP-200A碱性蛋白酶最适酶添加量为2 000 U/g,最适酶解时间为7 h,最适pH为8.0,最适酶解温度为50 ℃。在此基础上,进行正交优化组合试验,具体结果如表4所示。影响酶解液水解度的不同因素主次顺序为:酶解温度>酶添加量>pH>酶解时间。综合经济节约原则以及水解情况分析,得到AP-200A碱性蛋白酶最佳酶解条件为酶添加量2 000 U/g、酶解时间7 h、pH 8.5、酶解温度55 ℃。

表4 AP-200A碱性蛋白酶正交试验结果

2.2 FF106风味蛋白酶工艺优化

根据单因素试验,初步确定FF106风味蛋白酶最适酶添加量为1.25%,最适酶解时间为8 h,最适pH为6.5,最适酶解温度为55 ℃。在此基础上,进行正交优化组合试验,具体结果如表5所示。影响酶解液水解度的不同因素主次顺序为:酶添加量>酶解温度>酶解时间>pH。综合经济节约原则以及水解情况分析,得到FF106风味蛋白酶最佳酶解条件为酶添加量为1.25%、酶解时间为9 h、pH为6.5、酶解温度为55 ℃。

表5 FF106风味蛋白酶正交试验结果

2.3 双步酶法酶解鱿鱼加工副产物验证试验

对所得最佳酶解工艺条件进行验证试验,验证结果如表6所示。在上述最佳酶解工艺条件下所测得水解度分别为23.20%和33.90%,均略高于正交试验中水解度的最大值。高志中等[17]采用碱性蛋白酶和风味蛋白酶对鱿鱼蛋白进行复合酶解,最终得到酶解液水解度为30.40%。刘振锋等[18]使用碱性蛋白酶以及木瓜蛋白酶复配风味蛋白酶对鱿鱼蛋白进行分步酶解,最终得到酶解液的水解度为28.89%。本实验采用双步酶法所得酶解液水解度均优于上述研究,表明AP-200A碱性蛋白酶和FF106风味蛋白酶分步酶解工艺可以提高酶解液的水解度,提升原料的利用率。

表6 双步酶法验证试验结果

2.4 感官评价

在最优条件下,经两步酶解制得的鱿鱼加工副产物鲜味酶解液颜色呈黄褐色,质地澄清透明,有少量悬浮物,鱿鱼特征香气明显,有类似于虾油的香味,有少量腥味,鱿鱼特征鲜味明显,味道鲜美,有少量苦涩味,具有典型的海鲜风味。与一步酶解液相比,两步酶解液鲜味更加明显,鱿鱼特征风味更加突出,具体感官评分如表7所示。

表7 鱿鱼加工副产物酶解液感官评价结果

2.5 游离氨基酸组成分析

游离氨基酸是水产品重要的滋味物质,它们本身可以呈现鲜味、甜味、苦味等味道,还能与其他风味物质产生协同效应,影响酶解液的整体风味[19]。由表8可见,一步和两步酶解液中氨基酸种类没有差别,但是氨基酸的含量显著不同。两步酶解液中的总游离氨基酸和必需氨基酸含量分别为806.9 mg/100 mL和429.2 mg/100 mL,是一步酶解液的1.35倍和1.33倍,表明两步酶解可以将副产物中更多的蛋白质酶解成游离氨基酸,提高了蛋白质的利用率和酶解液的营养价值。两步酶解液中的鲜味氨基酸和甜味氨基酸含量为414.6 mg/100 mL,是一步酶解液的1.72倍,表明风味蛋白酶可以在碱性蛋白酶酶解的基础上游离出更多的鲜甜氨基酸。研究发现,当酶解产物中多肽的末端为疏水性氨基酸残基或多肽中含有较多的疏水性氨基酸时,易与苦味受体相结合,产生高强度苦味,而以单体形式存在的疏水性氨基酸的苦味则要弱得多[20]。由表8中数据可得,在酪氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和丙氨酸等疏水性氨基酸的含量上面,二步酶解液中含量为339.30 mg/100 mL,高于一步酶解液(265.10 mg/100 mL)。由此可见,风味蛋白酶含有内切和外切酶的特性,可以通过减少疏水性氨基酸在多肽中间和两端的占比,降低蛋白酶解产物的苦味。

表8 酶解液中游离氨基酸组成、呈味特性及TAV

此外,不同游离氨基酸含量的相对平衡关系与相互作用,也决定着食品的整体滋味感受与层次,呈味游离氨基酸的TAV越大,则对酶解液的整体滋味贡献越大[21]。因此,本研究进一步比较了酶解液中不同游离氨基酸的TAV。由表8可知,无论是一步酶解液还是两步酶解液,在所有游离氨基酸中TAV最大的氨基酸均为谷氨酸,TAV分别是2.50和3.22,而谷氨酸作为一种鲜味氨基酸,其鲜味最强,这也是鱿鱼加工副产物酶解液呈现鲜味的主要原因。另外,LIOE等[22]研究证明,在样品整体体系中,如若苦味氨基酸的含量低于其呈味阈值,则苦味氨基酸可以协助增强其他氨基酸的甜味和鲜味,因此,低于其呈味阈值的苦味氨基酸的存在,也可能是鱿鱼加工副产物酶解液呈现鲜味的一个重要原因。此外,从鲜甜氨基酸占总游离氨基酸比例来看,一步酶解液中鲜味氨基酸和甜味氨基酸占总游离氨基酸比例为40.49%,而两步酶解液中鲜味氨基酸和甜味氨基酸占总游离氨基酸比例为51.38%,鲜甜味氨基酸含量明显提高。综上所述,两步酶解工艺可以通过提升酶解液中谷氨酸等鲜味氨基酸的味觉作用,降低末端为疏水性氨基酸的苦味肽含量,提升酶解液的鲜味,使酶解液整体风味更佳。

2.6 酶解液分子质量分布

肽分子质量分布能够反映多肽分子质量的相对集中程度,是反映酶解程度的重要指标。采用高效液相色谱法得到标准物质的拟合直线方程为Y=-0.206 8X+6.65,其R2=0.996 3,说明线性良好。一步酶解液和二步酶解液的液相色谱洗脱图见图1、图2。根据标准方程对鱿鱼加工副产物酶解产物进行分子质量分析,计算各分子质量段(Mw<200 Da,200～1 000 Da,1 000～3 000 Da及3 000～5 000 Da)百分比,具体见表9。

图1 鱿鱼加工副产物一步酶解产物色谱图

图2 鱿鱼加工副产物两步酶解产物色谱图

表9 酶解产物多肽分子质量分布

由表9可知,经碱性蛋白酶酶解处理后,酶解产物的分子质量主要集中在3 000 Da以下,表明碱性蛋白酶的酶解效果较好,可以将副产物中的蛋白质高效地切割成分子质量3 000 Da以下的小肽。而经过两步酶解以后,1 000～3 000 Da分子段的小肽被继续分解,酶解液中游离氨基酸所占比例显著提高,最终酶解液中分子质量小于1 000 Da的小肽和游离氨基酸占比达91.98%。根据文献报道,分子质量小于3 000 Da的小肽对食品滋味的呈现有重要影响,是食品滋味的重要贡献者[23]。鲜味肽作为一种新型鲜味剂,分子质量大多小于3 000 Da,具有鲜味醇厚圆润、后味绵长的呈味特点,是对风味特别是鲜味贡献最大的成分之一,具有显著的鲜味呈现效果[24-25]。

研究发现,在目前已知鲜味肽中,鲜味二肽和三肽总量占鲜味肽总量的一半以上,其分子质量大多集中在1 000 Da以下[26]。因此,本实验采用双步酶法制备的鱿鱼加工副产物鲜味酶解液,其鲜味的提升一方面是通过分步酶解的方式实现了高效的酶切,促进鲜味氨基酸的释放,减少了疏水性氨基酸的释放和苦味的生成;另一方面也提示经分步酶解后产生的1 000 Da组分中可能含有丰富的鲜味肽相关成分。本实验也为后续深入研究鱿鱼加工副产物鲜味肽奠定了基础。

3 结论

本实验采用AP-200A碱性蛋白酶和FF106风味蛋白酶分步酶解鱿鱼加工副产物,以水解度为考察指标,探讨了酶添加量、酶解时间、pH值以及酶解温度对酶解效果的影响,得到双步酶法最佳酶解工艺条件。在此条件下,酶解液水解度最终可达33.90%,鲜甜氨基酸占比达51.37%,酶解液中相对分子质量小于1 000 Da的小分子肽和游离氨基酸可达91.98%。综上所述,双步酶法制备的鱿鱼加工副产物鲜味酶解液的整体分子质量较小,鲜味特征明显,研究结果希望为鱿鱼加工副产物的高值化利用以及制备呈味肽与鱿鱼特征风味调味品等提供理论基础。