深度测序技术在HIV感染并发眼内机会感染临床中的应用

王罗梓怡 姜靖 王志良

作者单位：复旦大学附属华山医院眼科，上海 200040

获得性免疫缺陷综合征（Acquired immunodeficiency syndrome，AIDS）又称艾滋病，是由人类免疫缺陷病毒（Human immunodeficiency virus，HIV）感染所致。截至2022年末，全球罹患HIV/AIDS约3 840万人，每年因AIDS死亡人数约65 万人[1]。AIDS可累及中枢神经系统、心脏、肠道、肺、肝、眼等多个器官，造成的并发症大大降低患者生存质量、缩短患者寿命。因此，HIV/AIDS及其相关并发症对各科医师而言仍然是1项严峻的全球性公共卫生问题。

HIV相关眼部并发症首次报道于1980 年，约70%艾滋病患者有眼部累及[2]。高效抗逆转录病毒疗法（Highly active antiretroviral therapy，HAART）可有效抑制体内病毒复制，但在规律HAART下，仍有20%～40%患者有眼部并发症，包括由病毒直接侵袭引起的非感染性血管病变和免疫缺陷所致相关机会性感染，病原体复杂，临床症状和体征多变，难以诊断鉴别。

快速准确地鉴定病原体是治疗HIV相关眼部感染、挽救视力、保住眼球的关键。由于眼球体积小，眼内液中细胞含量少，取样条件及数量有限，导致传统培养、鉴定病原体存在一定困难[3]。PCR是目前最主要的分子生物学检测方法，但存在样品污染、定向性检测需特异性引物等缺点。相比之下，mNGS仅凭极少细胞量即可对所有基因组序列进行广谱、高通量、无偏移的检测和分析，无需特异性引物，特别适用于培养和镜下阴性的感染性眼病[4]，对HIV相关眼部机会性感染的早期诊断具有重要意义。笔者将分类介绍mNGS技术在并发眼内机会性感染的AIDS患者进行无偏倚微生物检测分析中的应用。

1 NGS的基本原理

二代测序（Next generation sequencing，NGS）又称为高通量测序或深度测序，1 次可对几十万到几百万条DNA片段进行序列测定和分析，主要包括全基因组测序（WGS）、靶向下一代基因测序（tNGS）和宏基因组下一代基因测序（mNGS）等。其中WGS主要为微生物基因组的测序和组装，用于生物分型、流行病学、易感性预测和毒力分析等；tNGS则是在文库准备和测序之前使用筛选过程来富集感兴趣的微生物序列，用于高细胞样本中低数量的微生物序列[5]；而mNGS则具备高通量特性，同时对数百万个核酸序列进行扩增和测序，一次性得到样品中宿主和病原体的核酸序列，并与相应基因数据库中信息对比，进而鉴定出病原体，同时还可获得与病原体分型、毒力特性和耐药性、传播轨迹等相关的线索，是一种无假设、无偏倚的广谱检测手段，也是目前NGS应用于临床病原体检测的主要方法。

mNGS的检测平台众多，如Illumia（San Diego，CA）的HiSeq、NovaSeq平台，Thermo Fisher Scientific（Waltham，MA）的Ion Torrent平台、BGI（Cambridge，MA）的BGISEQ平台等[6]。不同平台的检测流程大致相同，一般分为样本采集和运输、核酸提取、文库制备、生物信息学分析、结果解读和生成报告，但硬件和软件的差异仍然使mNGS检测的设备操作和数据分析缺乏标准化规范和共识[7]。

2 NGS在HIV相关眼部机会性感染中的具体应用

HIV的眼部机会性感染主要包括病毒感染、细菌感染、真菌感染和寄生虫感染等。

2.1 病毒感染

2.1.1 CMVR 巨细胞病毒性视网膜炎（Cytomegalovirus retinitis，CMVR）是AIDS患者最常见的眼部机会性感染，也是引起视力下降最严重的原因。随着HAART的普及，CMVR的发生率从30%降至22%[8]。根据病变的位置分为外周型、中心型和混合型。其典型眼底改变为进行性坏死性全层视网膜炎，眼底可见棉绒斑，伴不同程度的视网膜内出血[9]，即“番茄奶酪样病变”。

血清学抗体对诊断CMVR无帮助，抗体滴度阳性只可反映既往感染，不能作为CMVR活动性的标志，阴性也不能完全排除CMVR，因AIDS患者的免疫抑制状态使CMVR可能无法达到检测的滴度。眼内液PCR分析是目前眼内CMVR感染的主要分子生物学检测手段。但由于PCR需要使用病原体的特异性引物进行扩增，因此检测往往是定向的。相比PCR，mNGS的高通量特性可在有限的标本中对所有基因组内容和转录组进行表征，特别是对于HIV眼部继发感染的患者，由于眼内液采集量有限，mNGS较传统检测手段能够对可能存在的病原体进行更早、更全面的筛查，尽早预防感染，针对性治疗，避免严重并发症的发生。

对于眼内液的检测，研究表明mNGS优于PCR。Doan等[10]对36 个PCR检查为阴性的玻璃体液样本进行mNGS，筛选出8例阳性样本，病原体包括CMVR、HSV、克雷伯杆菌等。此外，PCR检测阳性的12/41 例房水/玻璃体液样本均可在mNGS中测得阳性结果，还额外筛选出4例阳性样本，包括CMVR、弓形虫、风疹和纸样皮氏霉菌[11]，充分体现了mNGS广谱、高通量、更高灵敏度的特点。

此外，NGS还可在检测病原体的同时，将其基因与耐药数据库中的基因进行比对，进而发现病原体的突变位点，提供准确的耐药信息。mNGS对微小变异的检测更加灵敏，具有更强的复用能力[12]。Doan等[10]对7例CMVR的样本进行mNGS分析，发现3例具有更昔洛韦和缬更昔洛韦耐药性突变，这是传统检测和PCR所无法实现的。

2.1.2 VZV和HSV 疱疹病毒包括水痘-带状疱疹病毒（Varicella-Zoster virus，VZV）和单纯疱疹病毒（Herpes simplex virus，HSV），可在HIV感染的各个阶段被激活并迅速进展、累及全身各个器官。HAART前HIV相关VZV的发生率为0.7%～1%，HAART治疗后约0.6%。临床表现主要为眼部带状疱疹、并发或迟发性角膜炎、巩膜炎、葡萄膜炎和视网膜炎。偶有局部无皮肤表现的双侧带状疱疹性视网膜炎（1%），4%～17%的患者最终发展为坏死性疱疹性视网膜病变：急性视网膜坏死综合征（Acute retinal necrosis syndrome，ARN）和进行性外层视网膜坏死综合征（Progressive outer retinal necrosis，PORN）[13]。

目前疱疹病毒常用的诊断方法有定量PCR与IgM检测等。同仁医院梁庆丰团队成功使用NGS技术对眼内感染的玻璃体样本进行测序，成功检测出包括HSV、VZV等在内的多种病原体，其结果也可被PCR验证[14]。此外，通过对病毒序列的进一步分析，还可以探究病毒耐药机制、指导临床用药策略。早在2013 年，Andrei等[15]就从1 例接受过阿昔洛韦、更昔洛韦和膦甲酸钠治疗后复发的HSV患者中分离出HSV毒株，通过NGS发现了DNA聚合酶基因的2处突变与该毒株的耐药性有关。基于NGS快速、灵敏的检测方法将改进对耐药病毒中异质病毒群的筛选，监测其在抗病毒治疗期间的实时变化，从而更好调整治疗策略，改善抗病毒效果[16]。Koujah等[17]还通过NGS，发现不同临床表现的眼部HSV感染患者，其毒株的遗传序列存在的一些细微区别，导致病毒生长特性、侵入细胞能力以及细胞间传播能力的显著差异，导致临床症状严重程度的明显区别。由此可见，借助NGS对病毒遗传特性的全面检测，结合病毒表型与临床表现，可以对病毒的致病力展开进一步探索，通过评估病毒之间的遗传差异，预测可能的进化分歧及毒力、耐药表现。

2.2 真菌感染

2.2.1 念珠菌 念珠菌性眼内炎总体发病率较低，在HIV患者中总体感染率不超过1%，多发生于患者接受化疗、留置中心静脉导管、频繁使用抗生素、接受骨髓移植等情况时。念珠菌可累及双眼并侵袭脉络膜和视网膜，引起真菌性脉络膜炎和视网膜炎，表现为白点状病灶，通常累及视网膜内表面，边界不清，并可蔓延至玻璃体，因此可有轻度或弥漫性玻璃炎，更有甚者出现内源性眼内炎。

2.2.2 新型隐球菌 新型隐球菌常侵入中枢神经系统，继发脑膜炎及眼后节、视神经炎症，表现为脉络膜炎、脉络膜视网膜炎、眼内炎、视神经炎、脑神经麻痹和视乳头水肿（＜1%）。眼底表现呈多发黄色病灶，直径500～3 000 μm，还可表现为伴羊脂样KP的前葡萄膜炎、玻璃体炎，视网膜血管血管炎和视乳头水肿。一旦累及视神经、交叉和视神经束，则可造成视力丧失。

2.2.3 肺孢子虫 肺孢子虫是一种非典型的酵母样真菌，主要引起肺孢子虫肺炎，也可播散到其他器官导致肺外疾病[18]。累及眼部通常为双眼受累，典型临床特征为位于后极部单个或多个圆形黄白色扁平脉络膜病变。大部分患者通常无明显视觉症状。

目前，对眼部真菌感染的检查手段主要有标本培养和共聚焦显微镜，分子生物学检查主要依赖PCR。其中标本培养虽然被视为金标准，但经常受采样和培养条件限制，出现假阳性及假阴性，且培养周期往往较长；共聚焦显微镜检查的优势在于快速和无创，但无法对菌种进行鉴别，且只适用于眼表；PCR检测受限于采样位置病原体载量的差异，检测结果可能因样本来源不同而出现较大误差[19]，且定向性的PCR检查容易造成误诊、漏诊。相比之下，mNGS广谱、高通量检测的特性就显得尤为重要。Zhang等[20]发现mNGS在快速、精准的基础上，对免疫低下患者痰样本中肺孢子虫的检出率高达71.4%，而传统检测方法仅为23.8%[14]。Qian等[21]对15份可疑眼内感染的眼内液样本进行了NGS，发现部分患者存在真菌感染，然而，其中1例NGS检测时出现了假阴性，可能与采样及操作中的疏漏或差错有关。由此可见，眼内液的NGS检测有助于发现疑似眼内炎病例的病原体，但是其应用流程仍需进一步优化和规范以提高准确率和灵敏度。

2.3 细菌感染

相比病毒，细菌导致的机会感染在AIDS患者中发病率相对较低，但眼部细菌的分布和菌群可能发生变化，导致患者眼部并发症风险增加。Liu等[22]通过16S rRNA测序，对AIDS患者眼表刮片中的细菌进行了筛查，发现在HIV阴性、HIV阳性未治疗和HIV接受HAART的3 组被检者中，假单胞菌在眼表细菌中占绝对主导地位，且无论是否接受HAART，眼表微生物的总体丰度并无显著影响，但种类组成可不同。对36 例感染性眼内炎对玻璃体液或前房水同时进行传统的细菌真菌培养联合药敏试验和mNGS检测，结果显示mNGS的阳性率（88.89%）显著高于微生物培养（27.78%），同时mNGS共在9个病例中检出耐药基因。可见NGS能有效监测眼部微生物种群，并对眼部机会感染做出评估分析[23]。

HIV合并分枝杆菌眼内感染较为少见，主要包括结核类分枝杆菌和非结核类分枝杆菌（NTM）。结核分枝杆菌对眼部的损伤通过直接侵袭或炎症反应实现，可单眼或双眼累及，表现为明显的前房肉芽肿性炎症反应，伴瞳孔后粘连、玻璃体炎、视网膜血管炎、视神经炎、脉络膜炎和脉络膜结核[24]。NTM眼内感染以往更为罕见，但近年随着抗生素的大量使用、免疫缺陷人群的扩大、社区/医院获得性肺炎的增加，其发病率明显上升。与结核分枝杆菌类似，NTM感染眼部可表现为角膜炎、巩膜炎、泪囊炎以及后节的脉络膜炎和眼内炎等。

T-spot是临床中广泛用于检测结核感染的指标，敏感性高但特异性低，PCR（Xpert）用于结核病疑似的初步诊断，其敏感性也仅约为45.8%。mNGS的敏感性与Xpert近似，约为47.9%，但联合Xpert组合诊出率可提高至56.3%。可见，mNGS在结核分支杆菌检测的应用还需要更多的技术优化[25]。而对于NTM的NGS检测，目前主要集中在毒力、分型、基因多样性等研究层面，临床应用鲜有报道。本研究团队曾诊治过1例眼内炎病例，患者免疫功能低下，通过对玻璃体液的mNGS检测，最终诊断为NTM肺外播散感染，并根据NGS提供的耐药性分析及时使用了敏感药物利福布汀和克拉霉素，挽救了患者的视力。

2.4 梅毒螺旋体

眼梅毒是慢性梅毒的一种，病原体为苍白螺旋体，可累及所有眼部结构，在AIDS患者中进展更快，范围更广，临床表现缺乏特异性，漏诊和误诊较高[26]。传统检测方法包括病原学检测和血清学试验，前者是梅毒诊断的金标准，缺点是需要检验医师经验丰富，且培养困难，灵敏性差[27-28]，后者包括非密螺旋体和密螺旋体检测，缺点是特异性不强、成本高、耗时长[29]。此外，有研究表明，患活动性梅毒的HIV感染者中高达38%的个体在梅毒血清学试验中呈假阴性[30]。PCR用于早期梅毒的诊断灵敏性和特异性较好，也可检测出扁桃体、脊椎和眼部梅毒的非典型病例，但对潜伏期或慢性梅毒的检测仍存在缺陷，而mNGS可以检测培养条件苛刻的病原体，尤其是非典型病原体[31]。

2.5 寄生虫

眼部弓形体病是此类患者最常见的眼部寄生虫感染，由弓形虫所致，可无明显症状，但在免疫抑制或免疫缺陷情况下，眼部弓形体病通常表现为后葡萄膜炎，典型的视网膜脉络膜炎和局灶性坏死性肉芽肿性视网膜炎[32]。

眼弓形体病的诊断有赖于典型临床表现。弓形体的传统血清学检测灵敏度、特异性低[33]。PCR目前是弓形体感染的主要诊断工具，但眼弓形体病的PCR检测目前尚未标准化，对水和玻璃体的PCR检测阳性率仅为57%[34]。mNGS目前在弓形体的诊断中应用较少，Kruse等[35]对1例意识模糊、行为改变、抽搐的患者脑脓肿样本进行mNGS，意外发现99%（16S）和100%（D2LSU）的弓形虫序列，同时还测出HIV序列。这表明，在无法通过临床症状或临床检测寻找病原体的复杂感染患者中，NGS可能能够精确地寻找到少见的机会性致病原。

3 结论

NGS检测范围广谱，对多重感染的发现具有积极意义，对及早发现罕见病原体亦有重要价值，能发现传统手段无法检出和鉴定的病原体。同时，在测序覆盖度足够高的情况下，阴性结果有助于排除发生感染性疾病的可能。传统病原体培养耗时长，NGS测序周转时间根据平台而有所差异，能较早得知病原微生物结果，及时调整用药。

目前，mNGS的局限性在于：①标本在采集、运输及处理过程中的污染导致对分析结果造成干扰；②完整的NGS检测平台造价昂贵、操作复杂，尚不能广泛普及；③对于检测数据的分析有赖于庞大的数据背景以及合适的数学算法，技术门槛较高；④测序结果复杂，临床医师在既往临床理论和经验的基础上，需具备相关生物信息学知识，才能对测序结果进行正确的判断和解读。

机会性感染是HIV眼病最主要的病因，常因起病隐匿、症状不典型而难以察觉，一旦爆发又难以控制，引起不可逆转的视力损害，严重影响患者的生活质量。因此对眼部机会感染病原体的筛查是控制HIV眼病发生和进展、提高患者生存质量的关键。NGS的出现使简单、快速获得高通量、高精准度病原体遗传数据成为了可能，对HIV相关机会性感染眼病的病原体检测具有重大意义，通过对眼内液中病原体的检测，及早识别眼内感染的病原体，为临床诊疗、针对性用药提供帮助，控制病情进一步发展。诚然，这一技术目前仍存在一些缺点，离广泛应用尚存差距，但随着硬件设备的不断提升和软件支持的进一步完善，未来NGS有望成为HIV感染或AIDS患者眼部检查的常规选择，为HIV眼病的诊断和治疗提供确凿的依据和关键性线索。

利益冲突申明本研究无任何利益冲突

作者贡献声明王罗梓怡：收集资料，参与选题、设计及资料的分析和解释；撰写论文；根据编辑部的修改意见进行修改。姜靖：收集资料，参与选题、设计并修改论文。王志良：参与选题、设计、资料的分析和解释，修改论文中关键性结果、结论，根据编辑部的修改意见进行核修