单细胞转录组测序在糖尿病视网膜病变中的应用

牛栋玲 张妍春 刘红莉

作者单位：1西安市人民医院 西安市第四医院临床检验中心 西北大学附属人民医院，西安710004；2西安市人民医院 西安市第四医院 陕西省眼科医院 西北大学附属人民医院 西安市眼底病研究所，西安 710004

糖尿病视网膜病变（Diabetic retinopathy，DR）是1型及2型糖尿病（Diabetes mellitus，DM）最常见和最严重的并发症之一[1]，是糖尿病患者终末器官损伤在眼部的表现，可导致不可逆的严重视力损害，是工作人群致盲的首位病因。近年来，随着生活水平提高和生活方式改变，DM和DR的发病率均呈快速上升趋势。据2021年发布的第10版《全球糖尿病地图》统计，目前全球有5.37亿DM患者，预计2040年将攀升至6.42亿，其中大约2.24亿可能发展为DR[2]，DR防控形势十分严峻，诊疗面临巨大挑战[3]，亟需新的技术来深入探讨DR的发生发展机制，为制定更有效的检测、防控和治疗策略奠定基础。然而，DR发病机制错综复杂[4]，且视网膜是一个高度异质性的组织，视网膜不同细胞在疾病发生发展过程中如何变化，以及它们之间如何相互作用，仍有很多未知，DR发病机制很难剖析。单细胞转录组测序（single cell RNA-seq，scRNA-seq）能够在单细胞分辨率下解析DR中各种细胞类型的转录组特征、相互作用及其在疾病进展中的时序变化[5]，为阐明视网膜组织异质性和探索DR发病机制提供了高效方法。现就scRNA-seq的技术原理及其在DR中的应用，包括分析DR中主要的致病细胞类型和转录组特征、揭示DR发病机制、鉴定新的靶点和生物标志物等方面的研究进展进行阐述。

1 scRNA-seq特点及流程

细胞是生命结构和功能的基本组成单位，识别每一个细胞的基因表达特征具有重要价值。scRNA-seq通过分离和捕获单细胞，绕过了传统的基于组织样本的bulk RNAseq造成的种群数据相关的平均伪像，能够揭示单个细胞内RNA转录本的异质性和复杂性，允许对组织、器官、生物体内不同细胞类型进行分类和识别新的生物标志物，在揭示疾病病理过程、研究免疫微环境、探讨疾病转化、指导疾病早期诊断、靶向治疗、疗效监测和预后评估中发挥着越来越重要的作用[6]。

scRNA-seq的技术流程通常包括单细胞分离捕获、转录组扩增、文库构建、测序和生物信息学分析，其中单细胞分离和转录组扩增是关键步骤[7]。首先，需要通过机械或酶解离、荧光活细胞分选和微流控芯片等技术手段分离捕获单细胞；然后，提取单细胞的RNA，获得高质量、高纯度的RNA，进行反转录和扩增；接着，将扩增后的cDNA文库进行高通量测序和生物信息学分析。标准的scRNA-seq数据分析包括多个阶段，使用各种分析工具来完成[8]，如使用CellRanger获得每个细胞的基因表达矩阵，使用Seurat软件控制多细胞数据或低质量的细胞，获得高质量的表达矩阵。最后，利用免疫组化、原位杂交、基因工程细胞系模型和基因编辑技术等实验方法验证新鉴定的疾病相关基因或生物标志物。

2 scRNA-seq在视网膜研究中的应用

视网膜是中枢神经系统（Central nervous system，CNS）的一部分，是一个高度异质性的组织，包括神经元、神经胶质细胞和血管床细胞。哺乳动物的视网膜由神经视网膜（Neural retina，NR）和视网膜色素上皮（Retinal pigment epithelium，RPE）组成。NR由数亿个神经元构成，据估计有超过100种神经细胞亚型，每一种细胞亚群都具有特定的生理、形态和分子定义。2015年scRNA-seq被Macosko等[9]首次应用于视网膜分析，目前该技术正在成为揭示视网膜复杂性的最强大的工具之一，在构建视网膜细胞图谱[10]、鉴定视网膜细胞亚型[11]、揭示视网膜类器官细胞类型[12]、评估视网膜发育[13]、阐明视网膜再生调控网络[14]、解析视网膜疾病发病机制和挖掘潜在治疗靶标[15]等方面已经有所应用并取得了较大进展。例如，通过scRNA-seq技术成功建立了小鼠和人的视网膜细胞类型的转录组图谱，并发现了新的候选细胞亚型[9-10]，为研究视网膜细胞异质性提供了细胞图谱。通过比较中央凹区域和周边视网膜中不同分类细胞的转录组特征，揭示了中央凹区域独特的分子特性[16]。此外，通过比较胎儿视网膜和成熟视网膜组织的基因表达，为构建视网膜疾病的体外模型奠定了基础[17]。综上，鉴于scRNA-seq在探索视网膜疾病发病机制和挖掘潜在治疗靶标方面的巨大潜力，有学者建议将其作为开发视网膜疾病新型疗法的重要工具之一[18]。

3 scRNA-seq在DR中的应用

3.1 揭示DR发病机制和挖掘新诊疗靶点

血-视网膜屏障（Blood retinal barrier，BRB）受损是DR和糖尿病黄斑水肿（Diabetic macular edema，DME）的基本病理改变，其中内血-视网膜屏障（inner iBRB，iBRB）受损被认为是视网膜血管疾病的的主要原因之一。Wang等[19]通过scRNA-seq分析发现，Müller细胞、内皮细胞（Endothelial cells，ECs）和周细胞（Pericytes，PCs）是构成大鼠iBRB的主要细胞，其中CTXN3+ Müller细胞在BRB代谢废物清除、内皮损伤和血管生成方面具有潜在作用。Sampathkumar等[20]研究发现，DM和非DM下小鼠视网膜ECs和PCs的转录谱存在明显差异，在DM小鼠中，与血管新生、炎症通路和促凋亡通路激活相关的转录簇在ECs和PCs富集，而与内皮屏障维护相关的基因则显著下调。这些新基因和通路为解析DR早期iBRB的调控机制提供了重要信息。ECs介导血管功能并调节视网膜环境，是DR疾病的病理中心。Sun等[21]发现DM引起ECs大量基因表达失调，确认了DR特异性的ECs是来源于毛细血管的ECs，并且通过激活白介素-17（Interleukin-17，IL-17）在内的多条炎症通路，在导致炎症和加速DR进展中发挥作用，为DR病理机制的理解和潜在治疗靶点的筛选提供了新的线索。

炎症是早期DR的特征和DR发生发展的关键驱动力[22]。炎症细胞因子释放、免疫细胞激活和白细胞淤滞使得视网膜处于持续的慢性低度炎症状态，导致血管通透性增加和水肿加重，在DR发病机制中扮演重要角色。Lv等[23]利用scRNA-seq技术分析了链脲佐菌素（Streptozotocin，STZ）诱导的早期DR小鼠视网膜中的亚群细胞类型及其表达特征，发现小胶质细胞cluster36是早期DR视网膜炎症因子如IL-1β等的主要来源，小胶质细胞进行了代谢重编程，促进了其炎症激活，并进一步促进了DR早期进展，为通过改变小胶质细胞内代谢微环境治疗早期DR提供了理论依据。

最近的研究发现，早期DR患者即存在视网膜神经损伤和微血管变化，因此DR被认为是一种神经退行性疾病，但目前驱动DR神经病变的分子机制尚未阐明[24]。Yan等[25]分析来自健康供体的视网膜scRNA-seq数据，显示已知的DR基因的表达主要存在于视网膜神经节细胞（Retinal ganglion cells，RGCs）。Becker等[26]整合人视网膜mRNA、miRNA和scRNA-seq数据，发现在没有诊断为DR的DM患者中已经可见RGCs特异性基因的部分丢失，提示在DR早期已经存在RGCs损伤；而且RGCs特异性基因的表达在疾病进展过程中持续下调，提示在该病理状态下RGCs普遍丢失。Han等[27]利用CRISPR/Cas 9技术建立了pdx1基因杂合突变的斑马鱼模型，并进行高水平的葡萄糖处理，以模拟DR疾病进程。该研究发现，在视网膜微血管结构病变之前，视锥细胞的结构损伤就已经独立出现，其内外节长度随血糖升高显著缩短；进一步scRNA-seq显示，高血糖状态下，视锥细胞是最易受累的细胞类型，超极化激活的环核苷酸门控钾离子通道1（Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated potassium channel 1，HCN1）的基因表达随着疾病进展逐渐减少，提供了视锥细胞损伤是DR早期神经病变机制的新见解[27]。

3.2 在不同分期DR及DME标本中的应用

3.2.1 揭示早期DR的细胞类型和转录组特征 STZ诱导的DM小鼠视网膜属于早期DR模型，常用于早期DR发病机制研究。Sun等[21]通过对健康和STZ诱导的DM小鼠视网膜进行scRNA-seq，发现Cirbp、Rbm3、Mt1和Mt2等应激诱导基因在大多数类型的视网膜细胞中普遍被诱导，而双极细胞则几乎不受影响。基于Sun等[21]获得的scRNA-seq数据，Zhang等[28]进一步分析发现，DR早期可能与双极细胞、Müller胶质细胞、视网膜色素上皮细胞和视锥细胞的数量显著减少有关，但也与周细胞、视杆细胞、间变性细胞和小胶质细胞的数量显著增加有关，其中，Müller胶质细胞、小胶质细胞、内皮细胞和双极细胞亚群参与氧化应激和炎症相关通路，可能促进疾病进展，最终导致视力损伤和失明。Xiao等对DM猕猴视网膜的scRNA-seq分析显示，小胶质细胞是高血糖条件下受影响最显著的细胞类型，不仅其活化状态和炎症水平增加了，而且细胞间通讯强度也增强[29]。另外，有研究发现，在DM小鼠视网膜的Müller胶质细胞中，视黄醛结合蛋白1（Retinol binding protein 1，RLBP1）表达量下调，而过表达RLBP1能够缓解DR相关的神经血管变性，提示RLBP1可能是一个新的潜在治疗靶点[30]。这些研究为剖析早期DR的细胞和分子机制奠定了基础。

3.2.2 揭示晚期DR的细胞类型和基因特征 Akimba小鼠是能复现临床晚期DR特征的动物模型之一。Van等[31]对12周大的野生型和Akimba小鼠的视网膜组织进行scRNA-seq，发现Akimba小鼠的视网膜出现了视杆细胞退化、胶质细胞增生和炎性细胞活化的失调表现，并伴有代谢、免疫、氧化还原和金属离子失衡等转录改变。这些改变可能导致视网膜细胞的支持功能损害、离子和水稳态失衡、活性氧和促炎分子产生以及神经退行性变。此外，该研究发现大胶质细胞发生了反应性胶质增生，并且存在不同的促纤维化和促炎亚群，这些均参与DR发病过程[31]。另1项研究揭示了增殖性糖尿病视网膜病变（Proliferative diabetic retinopathy，PDR）中致病的主要视网膜细胞类型，显示视杆细胞、视锥细胞、双极细胞和血管内皮细胞与PDR的发生风险密切相关[30]。

纤维血管膜（Fibrovascular membranes，FVMs）的形成是PDR的关键病理标志之一。然而，由于使用传统的方法难以揭示不同细胞类型特异性基因表达的变化，目前对FVMs发病机制的了解仍非常有限。Hu等[32]使用scRNA-seq技术揭示了PDR患者FVMs细胞的异质性，在FVMs中确定了8个细胞簇，发现小胶质细胞（Microglia，MG）在FVMs中占比最大，活化的MG参与了FVM的形成，在PDR发病中起核心作用；将MG进一步细分为4个亚群：MG（1）、MG（2）、MG（3）和循环/增殖性MG，功能分析显示，MG（1）的主要功能并非以往研究认为的免疫调节作用，而是促纤维化及成纤维化。另1 项研究通过联合分析PDR患者和对照组的FVMs样本的bulk RNA-seq和scRNA-seq数据，确定了PDR的靶基因和细胞成分，发现CD44、细胞间黏附分子-1（Intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM1）和骨膜蛋白（Periostin，POSTN）与PDR发病密切相关，POSTN可能是关键配体[33]。这些结果为更深入了解PDR分子机制提供了补充信息，同时为发现PDR新的基因特征和精准治疗提供了理论基础。

3.2.3 探讨DME发病易感性及机制 DME是DR的严重并发症之一，而目前关于DME中不同免疫细胞类型的表型、功能多样性以及它们在新生血管生成和血管炎症中的作用知之甚少。Peng等[16]发现与黄斑水肿相关的血小板源性生长因子-B（Platelet derived growth，PDGF-B）和内皮素1（Endothelin 1，EDN1）基因的表达在视网膜中心凹中明显高于外周内皮细胞，这可能是该疾病中黄斑易感性增加的基础。Ma等[34]通过对健康个体和DME患者外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）进行scRNA-seq，发现单核细胞（Monocyte，MC）富含细胞因子通路和炎症激活的基因，是介导DME的主要促炎细胞，其中促炎性CD14++ MC富含促血管生成和促炎性通路，可通过细胞因子尤其是白介素-1β（Interleukin-1β，IL-1β）的产生启动炎症反应，并且可通过促进MC与其他免疫细胞之间的细胞间通讯而自募集和激活，在DME炎症过程中发挥重要作用。该研究基于scRNA-seq方法构建了DME患者的第一个免疫细胞图谱，并证实了DME患者外周血存在先天免疫调节障碍，提示促炎CD14++ MC可以作为未来抗炎治疗的潜在靶细胞群。

4 不足与展望

scRNA-seq在生物医学领域已取得显著进展，成为研究细胞类型、功能和相互作用的强大工具[35]。然而，实际应用中仍面临诸多局限和挑战，包括获取高质量的单细胞样本存在困难，样本制备及细胞捕获技术的偏差影响数据的准确性，检测灵敏度的限制导致低丰度转录物表达被低估，无法提供细胞在组织中的精确位置信息，批次效应与实验条件差异影响数据可比性和可重复性，以及数据分析解释复杂等。为克服这些挑战，研究者可采用测序深度增强、算法优化或与其他技术结合的方法提高scRNA-seq敏感性和准确性[36]；采用温和的组织处理方法[37]，减少细胞损伤和功能丢失；运用先进的生物信息学方法进行降维、聚类和差异分析[38]，提高数据处理准确性和效率；并结合空间转录组学技术[39]，实现细胞类型、功能和位置的综合分析。

目前，scRNA-seq在DR研究中已经取得一定进展，但仍具有巨大的潜力和广阔的应用前景。随着scRNA-seq应用于更多不同分期及表型的DR样本中，我们将更全面地了解DR的细胞异质性，挖掘关键细胞类型和信号通路，揭示疾病发生发展的机制。同时，通过前瞻性地纵向收集患者的OCT和血液样本等临床数据，利用多模态数据集深化对DR中细胞功能和状态变化的理解，以构建更完整的疾病模型。此外，通过scRNA-seq结合动物模型和体外细胞培养，并联合应用基因编辑、3D类器官培养和表观遗传修饰等技术，鉴定验证关键基因和通路，利用机器学习和深度学习技术挖掘新的生物标志物和治疗靶点，为临床诊疗提供证据支持。在未来，scRNA-seq有望发展成为用于基础研究和临床实验室的一个更完整、高通量、经济和易于操作的工具。

利益冲突申明本研究无任何利益冲突

作者贡献声明牛栋玲：参与选题、收集文献、撰写论文，根据编辑部的意见进行修改。张妍春：参与选题及文章构思，修改论文中关键性结果、结论，根据编辑部的修改意见进行核修。刘红莉：参与选题、文献的分析解释