眼内恶性肿瘤生物治疗的研究进展

李雨心 魏炜 陶勇 王晓君

作者单位：1首都医科大学附属北京朝阳医院眼科，北京 100020；2中国科学院过程工程研究所生化工程国家重点实验室，北京 100190

眼内恶性肿瘤主要起源于视网膜和葡萄膜，其中，视网膜母细胞瘤（Retinoblastoma，Rb）是最常见的婴幼儿原发性眼内恶性肿瘤，成人中则以葡萄膜黑色素瘤（Uveal melanoma，UM）最为常见[1]。目前已有多种方法用于Rb的治疗，Rb患儿的生存率和眼球保留率均有所改善，但对于复发性高和晚期顽固玻璃体腔种植Rb，现有的治疗方法如眼动静脉化疗、玻璃体腔化疗、放疗和玻璃体切割术等疗效均不佳。长期化疗会导致多药耐药性，使Rb转移及复发概率大大增加，同时可能导致骨髓抑制甚至继发性白血病[2]；放疗后可能出现放射性视网膜病变等严重并发症，最终导致视力丧失甚至眼球摘除[1]；玻璃体切割术由于术中或术后严重的并发症而备受争议。UM瘤体的血供丰富，常在疾病发生的早期通过血源性播散形成转移性葡萄膜黑色素瘤 （Metastatic uveal melanoma，mUM）。Shields等[3]发现分别有33%和25%的睫状体和脉络膜黑色素瘤患者在10年内发生转移，转移后1 年生存率约50%。虽然手术切除及放疗可以控制局部肿瘤，但仍有50%的UM患者最终发展为mUM[4]。由于UM血行转移可能在眼球摘除之前就已发生，因此，即使摘除了眼球，患者术后5年死亡率依然高达15%～53%[5]。面对UM的高转移风险以及提高眼球保留率、降低死亡率的需求，现有治疗方式对于保全患者的生命和视力依然面临着巨大的挑战。

随着生物技术的迅速发展，生物治疗作为一种新的治疗方法被广泛应用于多种肿瘤的治疗。相较于传统化疗和放疗，生物治疗可以靶向杀伤肿瘤细胞，安全性更高；相较于手术治疗，生物治疗有望控制和消灭体内微小残余病灶，防止肿瘤复发和转移；生物治疗还可以通过调动局部和全身的免疫反应增加晚期及转移性肿瘤缓解的概率，为提高眼内恶性肿瘤生存率和眼球保留率带来了新的希望。目前，免疫治疗、基因治疗、小分子抑制剂治疗（Small molecule inhibitor，SMI）以及溶瘤病毒疗法等多种生物治疗在眼内恶性肿瘤中的研究发展迅速。笔者将对上述生物治疗方法在眼内恶性肿瘤中的应用进展进行综述。

1 免疫治疗

正常情况下，机体免疫系统可以识别并清除肿瘤细胞，但肿瘤细胞为了生存，往往采用不同的策略使机体免疫产生抑制或耐受，如基因的改变使肿瘤细胞不能被免疫系统识别、肿瘤细胞表面产生免疫检查点等免疫抑制因子与免疫细胞相互作用产生免疫抑制效应、改变肿瘤周围正常细胞使其干扰免疫系统对肿瘤细胞的反应等。免疫治疗是通过增强机体免疫原性、免疫反应性及降低免疫抑制性，从而恢复机体正常的抗肿瘤反应，抑制肿瘤的生长和转移，在眼内恶性肿瘤中主要包括免疫检查点抑制剂治疗（Immune checkpoint inhibitors，ICIs）、过继免疫细胞治疗（Adoptive immunotherapy，AIT）、肿瘤疫苗及靶向肿瘤抗原的单克隆抗体或双特异性抗体等。

1.1 免疫检查点抑制剂治疗

ICIs通过抑制免疫检查点信号，切断肿瘤细胞与免疫细胞之间的相互作用，重新激活T细胞对肿瘤的免疫应答效应，从而达到抗肿瘤的作用。其中，程序性细胞死亡蛋白1（Programmed death-1，PD-1）、程序性细胞死亡配体1（Programmed death-ligand 1，PD-L1）及细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4（Cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4，CTLA-4）等抑制剂是目前研究最多、临床发展最快的ICIs方法[6]。ICIs的有效性取决于肿瘤微环境中免疫细胞的浸润情况以及免疫检查点的表达情况。Li等[7]将肿瘤分为免疫Ⅰ型肿瘤即“热”肿瘤（CD8+T细胞浸润和PD-L1阳性表达）以及免疫Ⅱ型肿瘤即“冷”肿瘤（几乎不存在或功能缺失的CD8+T细胞浸润和PD-L1阳性表达）。其中，ICIs对“热”肿瘤的治疗效果更佳。

Madigan和Penfold[8]认为Rb是一种免疫原性较差的“冷”肿瘤，对于ICIs的反应欠佳。有学者发现化疗后Rb肿瘤微环境中炎症细胞如CD4+、CD8+、颗粒酶-b+淋巴细胞和巨噬细胞浸润增加，肿瘤组织中CTLA-4 和PD-1 的表达升高[9]。Zhou等[10]发现在小鼠肿瘤移植模型中应用小分子抑制剂显著增强T细胞的浸润并提高ICIs的抗癌效力。由此，联合小分子抑制剂、化疗等治疗可能使“冷”肿瘤转换为“热”肿瘤进而提高ICIs对于Rb的疗效。

已有学者发现，单一使用PD-1/PD-L1 的抑制剂或与CTLA-4的抑制剂等联合应用治疗UM及mUM的效果欠佳，其可能原因为UM突变负荷低即免疫原性低、T细胞浸润少、以及PD-L1低表达等[11]。目前新免疫检查点及联合治疗UM的研究仍在进行中，比如：T细胞免疫球蛋白黏蛋白分子3和淋巴细胞激活基因3等；ICIs与其他疗法联合使用也正在开展临床试验[12]。

眼内恶性肿瘤的低免疫原性是ICIs反应差及产生耐药的最主要原因，因此与其他治疗如化疗、放疗等传统疗法相联合以发挥协同增效作用可能是未来的研究方向。另外，个体化肿瘤活组织检查及无创肿瘤监测方法如液体活检样本中的循环肿瘤DNA等新兴检测技术的发展有利于判断眼内肿瘤生物学亚型，为新的免疫检查点标志物、ICIs治疗反应的预测因素等提供更多有效的信息。

1.2 过继免疫治疗

通常在没有外界干预下，人体可以识别并杀伤肿瘤细胞的免疫细胞数目非常少。AIT通过向肿瘤患者输入经体外扩增、激活或修饰的免疫活性细胞如淋巴细胞或外周血单核细胞等，使其可以特异性识别肿瘤相关抗原，进而达到杀伤肿瘤的目的。AIT根据其发展历程依次包括自体淋巴因子激活的杀伤细胞、自体肿瘤浸润性淋巴细胞（Tumor infiltrating lymphocytes，TIL）、自然杀伤细胞、细胞因子诱导的杀伤细胞、细胞毒性T细胞（Cytotoxic T lymphocyte，CTL）以及细胞受体基因工程改造的T细胞（T cell receptorgene engineered T-cell，TCR-T）和嵌合抗原受体T细胞（Chimeric antigen receptor T-cell，CAR-T）等[13]。目前用于眼内恶性肿瘤的AIT包括CAR-T、TIL、TCR-T等。

Rb免疫微环境中浸润的免疫细胞及肿瘤细胞表面主要组织相容性复合体（Major histocompatibility complex，MHC）均较少，因此与之相关的TIL及依赖肿瘤MHC的TCR-T疗法的相关研究比较少见。Rb的CAR-T研究相对较多，目前Rb的CAR-T治疗主要基于2个靶点——神经节苷脂GD2和CD171[14]。Sujjitjoon等[15]开发了GD2 CAR-T的局部免疫治疗制剂，并证明其在Rb小鼠模型中有较好的抗肿瘤作用。Wang等[16]利用GD2 CAR-T联合可注射的水凝胶，在玻璃体腔给药后，延长了CAR-T的滞留时间并防止其扩散以减少脱靶效应。

部分学者认为UM的免疫原性高于Rb等肿瘤，可能更易接受TIL疗法[17]。在一项II期临床试验中，35%的UM患者单次输注TIL后肿瘤消退[18]。另外一项I期临床试验中，SLC45A2基因编码的膜相关黑素细胞分化抗原特异性自体CD8+T淋巴细胞与环磷酰胺、IL-2联合治疗mUM的疗效正在验证中[19]。双特异性融合蛋白Tebentafusp是一种基于免疫动员抗癌单克隆T细胞受体的TCR-T技术，可定向于UM细胞表面HLA-A2提呈的黑色素瘤分化抗原gp100蛋白的抗原肽以及靶向T细胞的CD3 蛋白，将T细胞募集到肿瘤中。在2项mUM临床试验中，Tebentafusp均收获了良好的治疗效果，且不良反应是短暂可控的[20]。在UM的CAR-T研究方面，Forsberg等[21]在2种葡萄膜黑色素瘤小鼠模型中应用了HER2 CAR-T，结果表明肿瘤体积均有减小。

目前，AIT应用于眼内恶性肿瘤时，需克服多方面的挑战。首先，眼内恶性肿瘤为实体瘤，为改善T细胞迁移和肿瘤浸润情况，需共表达趋化因子等提高肿瘤浸润能力。其次，相对于血液肿瘤，眼内恶性肿瘤的基因组更加不稳定，导致异质性增加，进而产生肿瘤抗原逃逸。因此，设计AIT时应构建多靶点以增强抗肿瘤疗效。另外，与血液肿瘤的靶点大多单一且特异不同，眼内恶性肿瘤中肿瘤特异性抗原很少，目前发现的眼内恶性肿瘤高表达的抗原如神经节苷脂GM3 等多为肿瘤相关抗原，在正常组织中也有表达，基于此类抗原的AIT很容易产生细胞毒性。因此，发掘新靶点、提高AIT的亲和性和敏感性可以更有效地对靶点低表达的肿瘤细胞发挥杀伤作用。此外，与皮肤黑色素瘤相比，UM通常包含少量的肿瘤新抗原，亟需探索更个性化的AIT治疗方法来克服这一障碍。最后，针对眼内恶性肿瘤的免疫抑制微环境，联合ICIs等抗免疫抑制的方法，可能会增强T细胞对免疫抑制的抵抗力。

1.3 肿瘤疫苗治疗

肿瘤疫苗是指将肿瘤抗原的不同种形式，如肿瘤相关蛋白或多肽、表达肿瘤抗原的免疫细胞等导入患者体内，克服肿瘤免疫抑制状态，重新激活肿瘤特异性T细胞，并增加肿瘤反应性T细胞应答的多样性，从而起到杀伤肿瘤的效果。另外，肿瘤疫苗还可以通过免疫记忆实现持续的肿瘤杀伤。目前，肿瘤疫苗在Rb中的研究较少。一种靶向神经节苷脂NcGM3 的抗独特性抗体疫苗-雷妥莫单抗在神经外胚层肿瘤患者中疗效得到了验证。但该研究仅纳入1例Rb患儿，对于Rb疗效的普适性还有待进一步研究[22]。

在UM的治疗方面，1项纳入14例mUM患者的前瞻性研究表明，接种了载有gp100 肽和酪氨酸酶肿瘤肽的自体树突状细胞的患者显示出良好的治疗效果[23]。近年来，基于mRNA的肿瘤疫苗显示出了巨大的潜力。现已开展多项基于RNA肿瘤疫苗治疗UM的工作：1 项III期临床试验（NCT01983748）正在招募3号染色体单体呈阳性的UM患者，患者将接种载有自体肿瘤RNA的树突状细胞；1项新的I期临床试验（NCT04335890）正在招募mUM患者，患者将接种载有肿瘤mRNA和驱动突变的RNA的树突状细胞以评估其疗效。

由于眼睛是独特的“免疫特权”器官，容易对肿瘤相关抗原产生免疫耐受，针对眼内恶性肿瘤组织的个性化肿瘤疫苗可能是未来研究的发展方向之一。眼内恶性肿瘤细胞中发生的突变可以产生新的自身抗原表位，称为新表位或新抗原，属于肿瘤特异性抗原的一种。相较于传统肿瘤相关抗原的疫苗，新抗原的个性化肿瘤疫苗具有如下优点：新抗原仅由肿瘤细胞表达，因此靶向性更高；新抗原源于体细胞突变的新表位，可能避开T细胞对自身表位的中心耐受，从而诱导对肿瘤的免疫反应。除此之外，更多肿瘤疫苗联合其他疗法的相关研究亟待开展。

2 小分子靶向抑制剂治疗

随着肿瘤生物学的飞速发展，抗肿瘤药物的研发重点正在从传统的细胞毒性药物转移到针对具有靶点特异性的新一代抗肿瘤药物。SMI通过使用药物或其他小分子物质特异靶向肿瘤周期相关因子、组蛋白去乙酰酶抑制剂、泛素-蛋白酶体通路等，阻断癌细胞的生长和扩散。不同于传统细胞毒性药物，小分子靶向抑制剂只对肿瘤细胞起杀伤抑制作用，因此具有靶向性强、毒副作用低等特点。研究表明，Rb中差异最大的分子途径是鼠双微粒体2/4-P53（Murine double minute 2/4, MDM2/MDM4）通路。MDM2/MDM4 可以抑制Rb中P53 的表达，并且可以促进P53 的泛素化降解[24]。Nutlin-3是一种选择性MDM拮抗剂，可特异性阻断P53 与MDM2/4 的相互作用，对Rb细胞系和异种移植肿瘤模型均具有较好的杀伤作用[25]。组蛋白去乙酰化酶（Histone deacetylase, HDAC）抑制剂可以通过抑制HDAC活性来增强P53 乙酰化水平，抑制MDM2 介导的P53 泛素化[26]。在过去的几年中，干扰表观遗传调控的新疗法在Rb中逐渐涌现：Zhang等[27]通过多组学研究表明伴随Rb1基因突变，表观遗传变化如SYK的上调共同参与了Rb肿瘤的进展；HDAC抑制剂可以抑制SYK与HDAC结合来调节转录，进而促使细胞凋亡。多数Rb是由遗传性基因突变引起的，少数非遗传性突变的Rb是由MYCN扩增引发的。BET蛋白抑制剂能够竞争性结合转录复合物活性结合区，使其从染色质区解离，从而抑制下游分子MYCN的表达。

在UM患者中，GNAQ/GNA11 基因突变率超过90%，是SMI治疗的理想靶点。对于具有此突变的UM患者而言，可使用特异的GαQ和Gα11 蛋白抑制剂或阻断Gα蛋白下游的信号通路传导的药物来进行靶向治疗。其中，最常见的Gα蛋白下游的信号通路包括哺乳动物雷帕霉素靶蛋白、细胞外信号调节激酶1/2信号通路和Yes相关蛋白信号通路等[28]。BAP1是一种位于染色体3p21.1上的肿瘤抑制基因，其缺失与UM的转移高度相关[29]。BAP1缺失导致组蛋白H2A过度泛素化和DNA甲基化，可通过HDAC抑制剂及应用溴结构域蛋白4的抑制剂来逆转[30]。SMI与其他治疗方法如ICIs的组合有望为眼内恶性肿瘤的治疗开辟新道路。近年来，无创液体活检技术不断发展，为动态分析眼内恶性肿瘤基因组及更好地发挥SMI抗肿瘤效能带来了新的希望。

3 溶瘤病毒治疗

溶瘤病毒是一种具有复制能力的病毒，能够选择性地感染体内外的肿瘤细胞，并在肿瘤中大量复制最终使细胞溶解。随着肿瘤细胞的溶解，释放出的大量病毒能够感染更多的肿瘤，进而产生病原相关分子模式、损伤相关分子模式等刺激DC细胞的抗原递呈诱导机体产生抗肿瘤反应。溶瘤病毒可以增强肿瘤的免疫原性、有效改善肿瘤微环境、对抗肿瘤免疫失调以及增强肿瘤细胞对放疗和化疗的敏感性。溶瘤病毒疗法还可以与基因疗法相结合，以增强靶向性以及抗肿瘤效应。目前，溶瘤性单纯疱疹病毒1型（HSV-1）、塞内加谷病毒（SVV-001）、脑心肌炎病毒（EMC）等在体外和体内实验中均被证明可有效治疗局部侵袭性和转移性Rb。在与基因治疗相结合的溶瘤病毒疗法中，一种转基因的5型溶瘤腺病毒VCN-01可以选择性地在Rb1通路功能障碍引起的具有高水平转录因子E2F-1的细胞中复制，而不会在正常视网膜中复制[31]。VCN-01的Ⅰ期临床研究正在进行中，初步结果显示其在1 例接受该治疗的Rb患者体内展示出较好的抗肿瘤活性[32]。传统治疗（如化疗和放疗等）可能会增强免疫系统的免疫抑制，从而使得机体允许腺病毒在宿主中复制所产生的效应。因此，对于Rb这类“冷”肿瘤而言，溶瘤病毒疗法与传统疗法的联合应用将会是未来的研究方向。

在UM异种肿瘤移植模型中，注射溶瘤HSV-1 的小鼠中局部肿瘤和远端皮下肿瘤体积均缩小。更重要的是局部肿瘤免疫微环境发生了变化，主要表现为巨噬细胞相关因子干扰素-γ的表达增加，巨噬细胞从M2 表型向M1 表型转变。Kimpel等[33]发现，大多数人类黑色素瘤对水疱性口炎病毒（Vesicular stomatitis virus，VSV）敏感。VSV联合转基因疗法治疗mUM患者的I期临床试验（NCT03865212）正在进行中。溶瘤腺病毒 （Oncolytic adenovirus，OAd）在激活天然免疫系统中发挥关键作用，还可以诱导DC细胞成熟和T细胞活化，从而在宿主体内激发体液和细胞免疫应答。一项UM体外实验表明，OAd H101与烷化剂联合应用可阻断细胞周期，发挥协同抗肿瘤作用[34]。随着生物技术的发展，更有效、更安全的溶瘤病毒疗法将是未来的发展方向，如应用具有眼内恶性肿瘤趋向性的载体细胞等增强溶瘤病毒的肿瘤趋向性，采用构建阳离子脂质体包裹溶瘤腺病毒等方式提高生物安全性、联合转基因提升其疗效等。

4 基因治疗

基因治疗是指在患者的肿瘤细胞中插入某种特定的基因片段、核酸物质或克隆基因，从而改变肿瘤细胞的行为，进而达到治疗目的。基因治疗主要包括基因沉默治疗、抑癌基因治疗及自杀基因治疗等。相较于其他疗法，基因治疗可以直接改变癌细胞遗传物质，具有适应证广和靶向性强等优点，且眼睛特有的生理特性更是为眼内注射治疗性病毒载体提供了有利的环境。

Rb常由Rb1 抑制基因的双等位基因失活引发，因此Rb1是常见的Rb基因治疗靶点[35]。除Rb1外，CKS1B是另一个针对Rb基因治疗的靶点。Zeng等[36]证明CKS1B在Rb细胞和组织中过度表达，沉默CKS1B基因可以抑制Rb细胞的生长和侵袭，同时抑制Rb的血管生成。除了基因沉默治疗和抑癌基因治疗，自杀基因也应用于Rb的研究中，并主要用于玻璃体腔内种植的晚期Rb治疗。Yi等[37]证明自杀基因单纯疱疹病毒胸苷激酶/丙氧鸟苷系统（Herpes simplex virus thymidine kinase/ganciclovir，HSV-TK/GCV）可导致Rb细胞系的死亡。

Jager等[38]发现了6 个变异基因与UM相关，分别是GNAQ、GNA11、BAP1、EPB41L3、EIF1AX和SF3B1，为该病的基因诊断与治疗提供了理论基础。除此之外，眼睛有适合基因治疗的3个主要特征即局部注射的可及性、利于适应病毒载体抗原性的免疫特权状态以及保护其他器官免受累及的血视网膜屏障，因此应用基因治疗的前景光明。在过去10年中，基因治疗的方向在不断发展，逐渐摒弃将经过基因改造的健康基因回输到人体内，转为精确修复细胞内的异常基因。CRISPR-Cas9 的发现更是为基因治疗的持续创新提供了动力。理论上来说，基因治疗可从根本上治疗疾病，但如何提高基因转染效率、提高基因表达效率以及降低其对机体器官功能的影响仍需进一步探索。

5 结语与展望

生物治疗在眼内恶性肿瘤的应用研究已有很多成功的案例，给肿瘤患者带来了新的希望。生物治疗与传统治疗相比，具有特异性更强、抗肿瘤更彻底等优势，可使正常组织的损伤达到最小化，是潜在替代放疗、化疗等传统疗法的新选择，为早期眼内恶性肿瘤带来了新的治疗模式。同时，生物治疗可杀伤组织内残余的微小病灶，有效防止癌症复发及转移，为玻璃体腔播散型Rb以及mUM等晚期眼内恶性肿瘤患者带来了保住眼球的希望。但是，生物治疗目前处于初步发展阶段，在临床上仍然不能完全取代传统治疗方式。

生物治疗在眼内恶性肿瘤治疗的应用中亟需解决的问题包括：发掘更多有效的肿瘤分子靶标，更精准有效地提高对肿瘤的杀伤力；生物治疗的效果存在较大的个体化差异，ctDNA等新型诊断模式有助于无创肿瘤基因组分析，为寻找能够有效预测治疗效果的生物标志物提供帮助，对于生物治疗在临床中的应用具有重要的意义；将生物治疗与化疗等传统疗法联用，发挥协同增效作用，可以探索出新的、更有效的精准治疗模式；根据生物治疗的性质、肿瘤的病理类型和发展趋势，结合患者特征有计划地治疗，可以最大限度地增加抗肿瘤效力、减少治疗造成的不良反应；眼内恶性肿瘤的治疗目标从最初的保命到保住眼球到现在的保视力，如何通过生物治疗最大限度地保留患者视力将是未来的趋势。另外，大型的多中心、双盲临床试验将提供可靠的循证医学依据，是眼内恶性肿瘤生物治疗的必经之路。伴随着生物技术的进步以及更多循证依据的产生，眼内恶性肿瘤的生物治疗必将迎来更美好的明天。

利益冲突申明本研究无任何利益冲突

作者贡献声明李雨心：调研文献，论文撰写，对编辑部的修改意见进行修改。魏炜：选题设定，终审论文，对编辑部的修改意见进行核修。陶勇：设计方案，终审论文，根据编辑部的修改意见进行核修。王晓君：设计框架，论文修订，对编辑部的修改意见进行核修