不同林地类型对白及生长及其内生真菌多样性的影响

李善敏，曾歆花，黄卫昌，付 浩，黄清俊

（1.上海应用技术大学生态技术与工程学院，上海 201418；2.上海辰山植物园华东野生濒危资源植物保育中心，上海 201602）

兰科内生真菌是指在兰科植物生活史中共生在其根或类根器官当中的所有类群真菌，包括菌根真菌、非菌根真菌及病原真菌等，其中兰科菌根真菌（Orchid mycorrhizal fungi，OMF）是一类对兰花单向或对真菌-植物两者双向有利的真菌类群[1]。菌根真菌对于提高兰科植物种子萌发率、原球茎的发芽率以及移栽植株的存活率至关重要[2]。有研究表明，不同生境下同种兰科植物可与不同种类的真菌共生，如生长在草甸和林地下的欧洲对叶兰（Neottia ovata）的内生真菌的物种组成存在显著差异[3]。纬度梯度和地理距离对兰科内生真菌也有较大影响，如欧亚绶草（Spiranthes spiralis）的OMF多样性会随着纬度的增加而降低[4]。加上区域间真菌的物种更替，OMF 群落会随着地理距离的增加，其相似性逐渐降低[5]。土壤养分也是影响兰科内生真菌类型的主要因素，BUNCH 等[6]的研究结果表明，杓兰（Cypripedium calceolus）的分布范围及其内生真菌类型不仅与其地理位置相关，还与土壤养分有密切联系。DAVIS 等[7]的研究结果表明，土壤养分是影响青须兰（Pheladenia deformis）分布和菌根真菌组成的主要限制性因素。但目前研究兰花内生真菌类型多与其广域的分布范围以及地理距离相联系，对于明确兰花内生真菌类型在不同生境下与生长状况的相关性方面的影响可能需要开展更多的研究。

白及（Bletilla striata）为兰科白及属多年生草本植物，具有很高的药用和观赏价值，其药用成分白及多糖被广泛应用于临床医学等领域[8]。此外，由于白及花色艳丽多样，花期较长和适应性强，在园艺方面也具有较好的应用。随着白及市场需求量的逐渐增加，白及开始大规模生产[9]。在林地资源紧张的情况下，复合经营成为一种常见且重要的种植方式。农林复合系统不仅有利于优化植物对资源和空间的合理利用，而且具有提高系统生物多样性，改善系统内部生态环境等多种生态系统服务功能[10-11]。目前，我国白及复合系统较多，主要有针叶林-白及[12]、银杏-白及-羊肚菌[13]、竹林-白及[13-14]等。但不同的林地类型对白及的生长发育有不同的影响[15-16]。为明确不同林地类型对白及生长发育及其与内生真菌共生关系的影响，拟选择上海市几种常见的林地类型[毛竹（Phyllostachys edulis）、红哺鸡竹（Phyllostachys iridescens）、落羽杉（Taxodium distichum）与水杉（Metasequoia glyptostroboides）]开展研究，筛选适合种植白及的林地类型，为实现白及林下有效栽培和林地综合开发利用提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验设计

试验地位于上海辰山植物园（31°04′26.31″N、121°10′50.37″E），该地属于北亚热带季风湿润气候，年平均气温15.6 ℃，年日照时长1 817 h，降水量1 313 mm。选择植物园主要的4种林地（红哺鸡竹、落羽杉、毛竹、水杉）类型开展研究。

挑选大小和长势基本一致的同批白及实生苗，于2021 年3 月在4 种林地以30 cm×30 cm 的株行距种植。于2022 年6 月进行样品采集，每种林地设置3个1 m×1 m 的样方，每个样方内随机采收8株。同时测定每个样方白及叶片光合指标，并采集每个样方0～10 cm 土壤样品，每种林地3个重复，共12个土壤样品。

1.2 测定方法

1.2.1 生长指标及生物量测定 白及苗采收后用清水将叶片、块茎和根系清洗干净，晾干水分。同时测量白及株高、叶宽、叶长、根长、地上部鲜质量、块茎鲜质量和根鲜质量等指标。随后将样品置于烘箱105 ℃杀青30 min、80 ℃烘干至恒质量，测量地上部干质量和地下部干质量等指标。

1.2.2 光合气体交换参数测定 于晴天9：00—11：00，使用Li-6400 便携式光合分析仪（Li-Cor，USA）进行气体交换参数测定，采用LED 红蓝光源，将光照强度（PAR）设置为1 000 µmol∕（m2·s），CO2浓度为400 µmol∕mol，流速为500 µmol∕mol。每种林地选择3～5 株生长状况基本一致的白及植株，对其同一生长部位的成熟叶片进行测定，重复3～5次。测定的指标包括净光合速率（Pn）、气孔导度（Gs）、蒸腾速率（Tr）、胞间二氧化碳浓度（Ci）等气体交换参数。

1.2.3 土壤养分测定 采用电位法测定土壤pH值；利用重铬酸钾容量法测定土壤有机质含量（OM）；利用半微量凯氏法测定土壤总氮含量（TN）；利用碱解扩散法测定土壤碱解氮含量（AN）；利用硫酸-高氯酸消煮法测定土壤全磷含量（TP）；利用火焰光度计法测定土壤全钾含量（TK）；利用碳酸氢钠法测定土壤速效磷含量（AP）；利用紫外分光光度计法测定土壤速效钾含量（AK）；利用土壤总氮与全磷含量的比值计算氮磷比[总氮∕全磷（N∶P）]。

1.2.4 高通量测序 每组处理选择3～5 株白及，每株采集3～5 个根段，用流动的清水洗净后，于超净工作台中灭菌（75%乙醇30 s、3.5%次氯酸钠4 min，用无菌水冲洗3 次后装入5 mL 离心管中）后存放于-80 ℃冰箱。参照E.Z.N.A.®Soil DNA Kit（Omega Bio-tek，Norcross，GA，U.S.）试剂盒说明书，提取白及样本中的微生物总DNA。采用ITS 全长引物ITS1Fngs（5′ - GGTCATTTAGAGGAAGTAA - 3′ ）∕TW14ngs（5′-CTATCCTGRGRGAAAYTTC-3′）进行PCR 扩增。PCR 反应体系：5×FastPfu Buffer 4 µL、2.5 mmol∕L dNTPs 2 µL、5 µmol∕L 正向引物0.8 µL、5µmol∕L反向引物0.8µL、FastPfu Polymerase 0.4µL和模板DNA 10 ng，以ddH2O 补足至20µL。扩增程序：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共35个循环；72 ℃延伸10 min，10 ℃保存。扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳后，采用 AxyPrep DNA Gel Extraction Kit（Axygen Biosciences，Union City，CA，U.S.）试剂盒进行纯化。根据说明书（Pacific Biosciences）通过平连接从扩增的DNA 中制备SMRTbell 文库。将每个样本连接特定的barcode序列后等质量混合，扩增子混合物使用Pacific Biosciences SMRTbellTMTemplate Prep kit 1.0试剂盒构建测序文库并在PacBio Sequel Ⅱ上测序。所有扩增子测序均由上海凌恩生物科技有限公司（中国上海）承担。使用SMRT Link Analysis 6.0 软件处理PacBio 原始read，以获得环形一致性序列（CCS）read：参数设置最小通过次数为3，最小预测准确度为0.99。原始read 通过SMRT Portal 处理，以筛选序列的长度（＜800 bp 或＞2 500 bp）和质量。通过去除barcode、引物序列、嵌合体并包含10 个连续相同碱基的序列进行进一步过滤。

1.3 数据处理与分析

使用上海美吉生物医药科技有限公司（Shanghai Majorbio Bio-pharm Technology Co.，Ltd.）的云平台进行交互式生物信息云分析。利用UPARSE 软件（Version7.1 http:∕∕drive5.com∕uparse∕）根据97%的相似度对序列进行OTU 聚类并剔除嵌合体。利用RDP classifier（http:∕∕rdPh.cme.msu.edu∕）对每条序列进行物种分类注释，比对SILVA 和UNITE 数据库。利用OTU 分析微生物群落结构组成、α 多样性、β 多样性、微生物与环境因子的相关性并制作图形。利用SPSS 22 对不同林地白及的生长指标、光合指标以及土壤养分指标进行ANOVA、相关性及差异显著性分析（P＜0.05）。利用Origin 2018 绘图，利用Adobe Photoshop CC 2018 进行后期图形处理。

2 结果与分析

2.1 不同林地白及生长指标分析

不同林地白及生长表现出一定差异。如图1所示，毛竹林地白及株高、叶长显著高于落羽杉林地，株高、叶长与叶宽显著高于水杉林地。红哺鸡竹林地白及株高、叶长、叶宽虽低于毛竹林地，但差异不显著；株高与落羽杉、水杉林地也无显著性差异；叶长显著高于落羽杉林地；叶宽显著高于水杉林地。毛竹林地白及分蘖芽数5 个，显著高于红哺鸡竹、水杉林地。毛竹林地白及根长显著高于其他3 种林地，其他3 种林地之间白及根长差异不显著。毛竹林地白及地上部、地下部鲜质量分别为352.34、689.25 g，均显著高于其他3 种林地。此外，红哺鸡竹林地白及地上部、地下部鲜质量低于落羽杉、水杉林地，但差异不显著。毛竹林地白及根冠比显著高于其他3种林地，具体表现为毛竹林地＞落羽杉林地＞水杉林地＞红哺鸡竹林地。

图1 4种林地白及生长指标Fig.1 Growth indices of four forest types of Bletilla striata

对4种林地白及叶片气体交换参数进行分析发现，毛竹林地白及的Pn为8.89µmol∕（m2·s），显著高于水杉、红哺鸡竹、落羽杉林地，其他3 种林地白及之间不存在显著差异。毛竹林地白及Gs 显著高于落羽杉、红哺鸡竹林地，Tr 显著高于落羽杉林地。水杉林地白及Ci为66.34µmol∕mol，高于其他3种林地，且显著高于落羽杉林地。落羽杉林地白及4 项光合指标均为最低（表1）。

表1 4种林地白及光合指标Tab.1 Photosynthetic indexes of four forest types of Bletilla striata

2.2 不同林地土壤养分分析

不同林地土壤OM、TN、AN、AP、TK 差异不显著（表2）。其中，水杉林地土壤OM、TN、AN、TP 高于其他3 种林地，但整体上差异不显著。毛竹、水杉、红哺鸡竹林地土壤pH 值显著低于落羽杉林地，其中红哺鸡竹林地土壤pH 值最低，为6.43。水杉、毛竹林地土壤TP显著高于红哺鸡竹林地，但与落羽杉林地不存在显著性差异。红哺鸡竹林地土壤AK 显著高于落羽杉林地，但与毛竹、水杉林地不存在显著性差异。红哺鸡竹林地土壤N∶P 显著高于其他3种林地（表2）。

表2 4种林地土壤养分指标Tab.2 Soil nutrient indices of four forest types

2.3 不同林地白及内生真菌物种组成分析

对4 种林地白及内生真菌种类进行OTU 水平α多样性分析发现，落羽杉林地白及内生真菌的Sob丰富度指数与Shannon 多样性指数最高，而毛竹林地白及最低（图2A、B）。Coverage 指数表明，4种林地的样本覆盖度在98.99%～99.06%（图2C），说明4种林地的数据量充足，每组样品的微生物种类均得到充分测量。

图2 基于OTU水平的4种林地白及内生真菌α多样性分析Fig.2 α-diversity analysis of endophytic fungi in four forest types of Bletilla striata at the OTU level

基于Bray-Curtis 距离对4 种林地样本进行非度量多维标尺分析（Nonmetric multidimensional scaling，NMDS）的结果表明，其stress 值为0.089，该值小于0.1，表明模型效果较好，说明不同林地间白及内生真菌组成存在一定差异（图3）。4 种林地的组间差异大于组内差异，表明林地类型对白及内生真菌组成存在较大影响，同时红哺鸡竹、水杉林地白及内生真菌群落组成变异较大，高于毛竹、落羽杉林地。

图3 4种林地白及内生真菌β多样性分析Fig.3 β diversity analysis of endophytic fungi in four forest types of Bletilla striata

不同林地白及的内生真菌种类在属水平存在一定差异，其中水杉林地白及内生真菌种类最多，达44 属；毛竹林地白及内生真菌种类最少，为30 属（图4A）。4种林地白及内生真菌的共有属为17个，红哺鸡竹、落羽杉、毛竹、水杉林地白及内生真菌特有属分别为12、7、6、17 个。4 种林地白及内生真菌的优势属均为担子菌门（Basidiomycota）的梨形孢属（Serendipita）（图4B）。但不同林地梨形孢属相对丰度有较大差异，其中毛竹林地白及梨形孢属相对丰度最大，为84.76%，水杉林地相对丰度最小，仅为43.11%，不同林地白及梨形孢属相对丰度具体表现为毛竹林地＞红哺鸡竹林地＞落羽杉林地＞水杉林地。毛竹、红哺鸡竹、落羽杉3种林地白及第二优势内生真菌均为担子菌门的Unclassified_c_Agaricomycetes，水杉林地白及第二优势内生真菌为子囊菌门的Unclassified_p_Ascomycota。红哺鸡竹、落羽杉、毛竹、水杉林地白及担子菌门内生真菌相对丰度分别为81.90%、74.50%、94.45%、47.95%，子囊菌门内生真菌相对丰度分别为17.50%、24.50%、4.530%、49.80%。除毛竹林地白及外，红哺鸡竹、落羽杉、水杉林地白及内生真菌中均含有子囊菌门茎点霉属（Dactylonectria）真菌和外瓶霉属（Exophiala）真菌，且相对丰度较高。

图4 4种林地白及内生真菌数量在属水平的Venn（A）和群落组成（B）分析Fig.4 Analysis of Venn（A）and community composition（B）of endophytic fungi abundance in four forest types of Bletilla striata at genus level

2.4 白及内生真菌与生长指标的关联性分析

冗余分析（Redundancy analysis，RDA）结果（图5A）表明，门水平上，99.67%的内生真菌都与白及的生长发育具有相关性。各生长发育指标均与担子菌门呈正相关关系，与子囊菌门呈负相关关系。其中内生真菌与白及的株高、叶长、叶宽3项指标相关性最强。在属水平上，白及株高与拟棘壳孢属（Pyrenochaetopsis）呈显著正相关关系，与Unclassified_p_Ascomycota、茎点霉属、外瓶霉属呈显著负相关关系（图5B）。白及叶长与梨形孢属、拟棘孢壳属呈显著或极显著正相关关系，与罗丹赛伯林纳德氏属（Cyberlindnera）、Unclassified_p_Ascomycota、茎点霉属、Unclassified_f_Nectriaceae、外瓶霉属呈显著或极显著负相关关系。白及根粗与Unclassified_c_Herpotrichiellaceae、Unclassified_c_Sordariomycetes 呈显著负相关关系。白及地上部、地下部鲜质量和干质量均与梨形孢属呈显著正相关关系，同时除地下部干质量外，均与Unclassified_f_Herpotrichiellaceae、茎点霉属呈极显著或显著负相关关系。白及根长与Nepyrenochaeta呈显著负相关关系。白及叶宽与盘刺孢属（Colletotrichum）呈显著正相关关系，与Unclassified_p_Ascomycota、背 芽 突 霉 属（Cadophora）、Unclassified_c_Sordariomycetes 呈显著或极显著负相关关系。分蘖芽数与梨形孢属、Unclassified_o_Sebacinales 呈显著正相关关系，与背芽突霉属呈显著负相关关系。

图5 白及生长指标与内生真菌关联性分析Fig.5 Correlation analysis between growth indicators and endophytic fungi in Bletilla striata

2.5 白及内生真菌与土壤养分的关联性分析

基于斯皮尔曼系数（Spearman coefficient），将pH 值和8 种土壤养分AK、N∶P、TP、AP、TK、AN、OM、TN与白及内生真菌进行关联性分析发现，在门水平上，79.12%的真菌与土壤养分具有相关性。其中TP、AN、TK、OM 以及AP 主要与子囊菌门真菌呈正相关关系，与担子菌门呈负相关关系；AK、N∶P主要与担子菌门呈正相关关系，与子囊菌门呈负相关关系；pH 值和TN 与两者的相关性较弱（图6A）。整体而言，白及内生真菌种类受土壤pH 值、TP、AN、OM、TN 影响较大。在属水平上，N∶P 与Unclassified_c_Leotiomycetes 呈显著正相关关系。OM 与Neopyrenochaeta呈显著正相关关系，与Unclassified_c_Agaricomycetes、枝 孢 霉 属（Cladosporium）呈显著负相关关系。pH 值、TP、AN、TN 分 别 与 Unclassified_c_Herpotrichiellaceae、Unclassified_c_Leotiomycetes、Unclassified_o_Xylariales、Unclassified_o_Xylariales 呈显著负相关关系（图6B）。

图6 白及其内生真菌与土壤养分的关联性分析Fig.6 Correlation analysis between endophytic fungi and soil nutrients in Bletilla striata

3 结论与讨论

3.1 讨论

3.1.1 林地类型对白及生长发育的影响 林地类型对白及生长发育有重要影响。本研究中，毛竹林地白及株高、叶长、叶宽、分蘖芽数、根长、地上部和地下部鲜质量以及根冠比等各个指标均显著高于其他3 种林地类型。这表明相比其他林地类型，毛竹林地白及的生长状况最佳。推测这与不同林地条件下植被类型、光照条件和土壤养分等的差异有关。有研究表明，植被类型影响了根系代谢物、免疫系统功能及根系分泌物的组成，进而影响了微生物的活动和结构[17]。此外，植被类型还会影响温度和光照的日、年变化[18]。周一冉[19]研究发现，白及在林地郁闭度为20%～90%的地区均可生长，但当郁闭度在45%～55%时，其生长状况最好。一定范围内光强的增加可以提高光合产物的积累，利于根、冠的生长[20]，这与本研究中毛竹林地白及叶片的Pn、根冠比显著高于其他3 种林地类型的研究结果一致。土壤养分对植株生物量有较大影响[21]。磷、钾含量增加可促进光合产物向地下部的运输积累[22]，这与本研究中毛竹林地土壤的AP、TK 最高，且地下生物量极显著高于其他3组的结果相一致。菌根真菌是影响兰科植物生长发育的重要因子，同时也是决定兰科植物的物种丰度以及分布范围的重要因素[23]。本研究中，4 种林地白及内生真菌的优势种均为担子菌门的梨形孢属真菌。门水平上，毛竹、落羽杉和红哺鸡竹林地白及内生真菌以担子菌门真菌占主要地位，而水杉林地白及则以子囊菌门真菌占优势。同时，从生长指标与内生真菌的关联性分析中可以看出，白及的生长发育与担子菌门真菌呈显著的正相关关系，与子囊菌门呈负相关关系。这表明担子菌门真菌对4种林地白及的生长发育起到关键性作用。属水平上，白及的生长指标主要与梨形孢属等真菌呈显著正相关关系，与茎点霉属和Unclassified_f_Herpotrichiellaceae 等真菌呈显著负相关关系。本研究中，毛竹林地白及生长状况最好，其地下部生物量也显著高于其他3 种林地，同时其梨形孢属真菌的相对丰度也最高。这表明菌根真菌的相对丰度越高越有利于白及的生长，这与学者得出的梨形孢属真菌有利于兰花地下部生长的结论[15]较为一致。子囊菌门作为土壤中广泛的真菌类型，多作为土壤中的分解者存在，为腐生菌[24]。本研究中，除毛竹林地外，其他3 种林地白及菌根均检测到子囊菌门的茎点霉属真菌，而茎点霉属真菌是白及根腐病的主要致病菌[25]。由此推测，落羽杉、水杉和红哺鸡竹林地白及生长状况和生物量均低于毛竹林地白及，可能是由于受到病原菌的侵染，导致白及根系产生病害，造成生长受阻。

3.1.2 林地类型对白及内生真菌的影响 林地类

型对白及内生真菌的组成、群落结构和丰度有一定影响。本研究中，毛竹、落羽杉和红哺鸡竹林地白及的内生真菌中担子菌门占主要地位，而水杉林地白及则为子囊菌门真菌占优势。4种林地类型下白及优势内生真菌均为梨形孢属，以毛竹林地白及相对丰度最高，水杉林地相对丰度最低。此结果可能是由不同林地条件下土壤养分、光照和植物种类的差异造成。

土壤养分会在一定程度上影响白及内生真菌的种类。通过对内生真菌和土壤养分进行关联分析后发现，土壤养分可解释门水平上79.12%的内生真菌变异情况。其中TP、AN、TK、AP 等主要与子囊菌门真菌呈正相关关系，AK、N∶P 与担子菌门呈正相关关系。属水平上，外瓶霉属和茎点霉属真菌与磷含量相关性较强。水杉林地白及内生真菌中茎点霉属和外瓶霉属的相对丰度最高，可能是由于水杉土壤中磷含量较高造成，因为较高的磷含量会促进子囊菌的增殖。有研究表明，土壤养分如氮、磷等的含量与兰花的内生真菌群落结构具有一定的相关性，且在低磷条件下，菌根真菌更容易与植物建立共生关系[6，26]，如红哺鸡竹林地白及的伞菌纲、梨形孢属和胶膜菌属等OMF 相对丰度高于水杉林地。

光照对白及内生真菌的种类也会产生一定影响。FU 等[15]的研究结果表明，光照强度与OMF 梨形孢属呈显著正相关关系，与茎点霉属呈显著负相关关系。本研究中，毛竹林地中郁闭度最低，光照强度最大，梨形孢属相对丰度最高，茎点霉属相对丰度最低。由于不同林地的郁闭度有所区别，导致土壤的受光面积会产生一定差异，从而影响林地土壤的温湿度[27]、含水量和土壤微生物的群落组成[28]，进而影响白及内生真菌的组成结构。植物-土壤互作同样影响白及内生真菌组成。植物根系通过向土壤释放有机物来提高土壤养分、改变土壤性质，为土壤微生物提供食物和生存场所，微生物则将土壤中的有机废物分解为植物可利用的形式促进植物的生长[29]。由于兰科植物的特殊性，白及根系会不断与土壤中的真菌进行共生，促进对土壤养分的获取。但不同的植物根系分泌的有机质不同，导致土壤微生物的群落结构[30]以及白及内生真菌的组成产生一定差异。

3.2 结论

林地类型对白及的生长发育和内生真菌的组成有显著影响。本研究中，4 种林地白及生长指标差异较大，毛竹林地种植白及效果最好。不同林地类型白及内生真菌种类也具有一定差异，4 种林地白及内生真菌的优势种群均为担子菌门的OMF 梨形孢属，且毛竹林地相对丰度最高，水杉林地最低。水杉林地土壤磷含量较高，病原菌增殖快，导致整体上内生真菌相对丰度较低、植株产生病害、生物量低。内生真菌群落组成对白及生长指标有显著影响，整体上内生真菌相对丰度越高，白及生长状况越佳。因此，在对白及进行农林复合经营以及植物景观配置时，应注意选择合适的林地类型如毛竹林地，并考虑光照、土壤养分以及微生物种类等因素对白及生长发育的影响。在适当条件下还可以施用有机肥或菌肥等调节土壤养分以及微生物种类，以达到最佳种植效果。