不同成熟度秋福红树莓果实中酚类物质含量的比较

李 程，张瑞杰，李 明，孙 权，赵志磊，顾玉红

（1.河北农业大学生命科学学院，河北 保定 071001；2.河北大学质量技术监督学院，河北 保定 071002）

红树莓（Red raspberry）属蔷薇科（Rosaceae）悬钩子属（RubusL.）小浆果，是由多层成熟的小核果排列紧密形成的聚合果，果实空心，似帽子。广泛分布于欧洲、北美、南非和亚洲（我国东北、华北、西北）地区，果实口感酸甜，营养丰富，具有很高的药用价值，在现今世界广受欢迎的第3 代水果中出类拔萃，深受消费者的喜爱。红树莓果实常用作鲜食、果汁、果酒、果茶等，果实中酚类物质含量的高低是决定红树莓果实营养及医疗保健价值的重要因素，也有研究以酚类物质含量的多少作为果实品质的评价条件[1-2]。

在植物体内莽草酸途径主要合成酚类化合物，包括鞣花酸、水杨酸、阿魏酸、咖啡酸、儿茶素、表儿茶素等物质。其中，鞣花酸是五倍子酸的二聚衍生物，它是一种广泛存在于植物中的天然多酚成分，可以清除自由基和抑制脂质过氧化。研究表明，红树莓果实中的鞣花酸对肝癌[3]、乳腺癌、结肠癌等癌症均有抑制作用，还能降低胆固醇、减轻肥胖[4]，抵抗金黄色葡萄球菌、肠炎沙门氏菌及大肠杆菌感染，促进伤口愈合[5]等，具有重要的医疗价值。水杨酸是植物体内普遍存在的一种内源性信号分子，也可通过喷施外源水杨酸提高植物的抗逆性，对植物的生长发育过程有重要影响。有研究表明，对苹果果实外施萝卜粗提过氧化物酶和水杨酸，可以明显提高苹果果实的品质[6]。水杨酸可解热镇痛，通常用于制备乙酰水杨酸、水杨酸钠等药物，还应用于化妆品、香精、防腐剂等领域，用途广泛。阿魏酸和咖啡酸是肉桂酸的衍生物，具有抗癌、抗氧化和抑菌活性[7-8]，均可用于化妆品中。黄酮类化合物是酚类物质中具有活性的天然产物，在某些植物和浆果中广泛存在，对人类机体的正常发育、疾病的预防和治疗方面均有极其重要的作用。表儿茶素是来源于植物中的天然黄烷醇化合物，可以抗抑郁[9]、治疗镰刀型细胞贫血症，在红细胞膜稳定性方面表现出强大的作用[10]；儿茶素与表儿茶素互为同分异构体，是从天然植物中提取出来的一类酚类活性物质，可以保护肝脏，能有效地减轻氨基酸和天冬氨酸诱导的肝毒性[11]，有效对胶原卟啉单胞菌诱发的人牙龈上皮细胞炎症反应进行抑制，还可用于预防或减轻牙周炎；芦丁又称维生素P，是一种天然的黄酮苷，广泛存在于各种蔬菜、水果中，具有抗菌、抗氧化[12]的作用，还能够保护肝脏[13]、增加骨密度、缓解骨质疏松等。

红树莓品种秋福（Autumn Bliss）的果个较大，口感好，耐寒能力强、适应性好[14]。目前对于秋福红树莓的研究主要集中在栽培[15]、离体再生[16]等方面，秋福果实物质含量的研究很少见，关于秋福红树莓果实4 个发育时期（青果、黄果、红果、深红果）多种酚类物质含量的变化尚未见研究，鉴于此，通过分析秋福红树莓不同成熟度果实中的鞣花酸、水杨酸、阿魏酸、儿茶素、表儿茶素、芦丁、咖啡酸和总黄酮含量，研究秋福红树莓果实发育过程中酚类物质的变化规律，确定其各物质的最佳采收期，为红树莓果实中酚类物质的深入研究以及相关产品的研发提供理论基础，推动树莓产业的发展。

1 材料和方法

1.1 试验材料

秋福红树莓采自河北省邢台地区红树莓基地（36°55′N～37°06′N，114°36′E～114°52′E）。采集青果、黄果、红果、深红果，经液氮速冻后，-80 ℃冻存备用。

1.2 测定项目及方法

鞣花酸[17]、水杨酸[18]、阿魏酸、儿茶素、表儿茶素、芦丁[19]、咖啡酸的提取采用1%盐酸的甲醇浸提法，其含量的测定均采用高效液相色谱（HPLC）法，色谱条件的设定和流动相梯度设置如表1、2所示。

表1 色谱条件Tab.1 Chromatographic conditions

表2 流动相梯度设置Tab.2 Mobile phase gradient settings

制备标准溶液：分别使用电子天平称取鞣花酸标准品0.5、1.0、1.5、2.5、7.5 mg，使用二甲基亚砜对标准溶液进行溶解，定容至25 mL，使用0.45µm 微孔滤膜过滤，得鞣花酸标准溶液，供HPLC 检测；分别称取水杨酸标准品1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mg，用甲醇溶解，定容至50 mL，使用0.45µm微孔滤膜过滤，得水杨酸标准溶液，供HPLC 检测；分别于100 mL容量瓶中称取咖啡酸、儿茶素、表儿茶素、芦丁和阿魏酸各100 µg，使用甲醇溶液（pH=2）定容，将母液分别稀释为2、4、6、8、10 µg∕mL，过滤操作使用0.45µm 微孔滤膜进行，分别得咖啡酸、儿茶素、表儿茶素、芦丁和阿魏酸标准溶液，供HPLC 检测。以峰面积为横坐标，标准品浓度为纵坐标绘制标准曲线，得到7 种酚类物质的线性关系（表3），鞣花酸的标准曲线在20～300 µg∕mL 范围内线性良好（R2＞0.999），水杨酸的标准曲线在20～100 µg∕mL 范围内线性良好（R2＝0.999 9），阿魏酸、儿茶素、表儿茶素、芦丁、咖啡酸的标准曲线在2～10 µg∕mL 范围内线性良好（R2＞0.996）。

表3 秋福红树莓7种酚类物质的线性关系Tab.3 Linear relationship of 7 phenolic substances in Autumn Bliss red raspberry

每个指标需要进行3 次重复测量，数据均为3次重复测量的平均值。

总黄酮含量测定使用分光光度计法，吸取0.2 mg∕mL 的芦丁溶液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL，按照三氯化铝-亚硝酸钠缓冲溶液显色法（表4），使用分光光度计测定出样品提取液位于510 nm 处的吸光值。以芦丁质量浓度（µg∕mL）为横坐标、吸光度为纵坐标作出线性回归方程[y=7.541 4x-0.006 2（R2=0.999 6）]。

表4 总黄酮含量测定体系Tab.4 Determination system of total flavonoids

1.3 数据处理

采用软件Excel 2007 和DPS 7.05 进行数据统计分析和差异显著性分析，利用SPSS 21.0 软件进行Pearson相关性分析。

2 结果与分析

2.1 不同成熟度秋福红树莓果实中鞣花酸含量的比较

从图1可以看出，鞣花酸含量在8.65～49.88 mg∕g，从青果发育到深红果的过程中呈下降趋势，鞣花酸含量最大的是青果时期（49.88 mg∕g），极显著（P＜0.01）高于黄果、红果、深红果，分别是其含量的4.8、4.9、5.8 倍。秋福红树莓果实的鞣花酸含量为深红果时期＜红果时期＜黄果时期＜青果时期，即以秋福红树莓为材料获得高含量的鞣花酸，采摘青果更好。

图1 秋福红树莓4个发育时期果实中的鞣花酸含量Fig.1 Ellagic acid content of Autumn Bliss red raspberry fruits in four development stages

2.2 不同成熟度秋福红树莓果实中水杨酸含量的比较

从图2可以看出，水杨酸含量在0.10～0.27 mg∕g，从青果发育到深红果的过程中呈先上升后下降趋势，水杨酸含量最大的是红果时期（0.27 mg∕g），极显著（P＜0.01）高于青果、黄果、深红果，分别是其含量的2.7、2.4、1.2 倍。秋福红树莓果实的水杨酸含量为青果时期＜黄果时期＜深红果时期＜红果时期，即以秋福红树莓为材料获得高含量的水杨酸，采摘红果更好。

图2 秋福红树莓4个发育时期果实中的水杨酸含量Fig.2 Salicylic acid content of Autumn Bliss red raspberry fruits in four development stages

2.3 不同成熟度秋福红树莓果实中阿魏酸含量的比较

从图3可以看出，阿魏酸含量在0.15～0.53 mg∕g，从青果时期发育到深红果时期的过程中阿魏酸含量先下降之后再上升，阿魏酸含量最大的是青果时期（0.53 mg∕g），极显著（P＜0.01）高于黄果、红果、深红果，分别是其含量的1.3、3.4、2.7 倍。秋福红树莓果实的阿魏酸含量为红果时期＜深红果时期＜黄果时期＜青果时期，即以秋福红树莓为材料获得高含量的阿魏酸，采摘青果更好。

图3 秋福红树莓4个发育时期果实中的阿魏酸含量Fig.3 Ferulic acid content of Autumn Bliss red raspberry fruits in four development stages

2.4 不同成熟度秋福红树莓果实中儿茶素含量的比较

从图4可以看出，儿茶素含量在1.46～3.74 mg∕g，从青果发育到深红果的过程中呈下降的趋势，儿茶素含量最大的是青果时期（3.74 mg∕g），极显著（P＜0.01）高于黄果、红果、深红果，分别是其含量的1.5、2.1、2.6 倍。秋福红树莓果实的儿茶素含量为深红果时期＜红果时期＜黄果时期＜青果时期，即以秋福红树莓为材料获得高含量的儿茶素，采摘青果更好。

2.5 不同成熟度秋福红树莓果实中表儿茶素含量的比较

从图5 可以看出，表儿茶素含量在1.42～4.91 mg∕g，从青果发育到深红果的过程中呈下降的趋势，表儿茶素含量最大的是青果时期（4.91 mg∕g），极显著（P＜0.01）高于黄果、红果、深红果，分别是其含量的2.0、2.6、3.4 倍。秋福红树莓果实的表儿茶素含量为深红果时期＜红果时期＜黄果时期＜青果时期，即以秋福红树莓为材料获得高含量的表儿茶素，采摘青果更好。

图5 秋福红树莓4个发育时期果实中的表儿茶素含量Fig.5 Epicatechin content of Autumn Bliss red raspberry fruits in four development stages

2.6 不同成熟度秋福红树莓果实中芦丁含量的比较

从图6可以看出，芦丁含量在0.012～0.017 mg∕g，从青果发育到深红果的过程中呈下降的趋势，芦丁含量最大的是青果时期（0.017 mg∕g），极显著（P＜0.01）高于黄果、红果、深红果，分别是其含量的1.4、1.4、1.5 倍。秋福红树莓果实的芦丁含量为深红果时期＜红果时期＜黄果时期＜青果时期，即以秋福红树莓为材料获得高含量的芦丁，采摘青果更好。

图6 秋福红树莓4个发育时期果实中的芦丁含量Fig.6 Rutin content of Autumn Bliss red raspberry fruits in four development stages

2.7 不同成熟度秋福红树莓果实中咖啡酸含量的比较

从图7可以看出，咖啡酸含量在0.04～0.53 mg∕g，从青果时期发育到深红果时期的过程中咖啡酸含量先下降后上升，咖啡酸含量最大的是青果时期（0.53 mg∕g），极显著（P＜0.01）高于黄果、红果、深红果，分别是其含量的4.7、12.6、3.7 倍。秋福红树莓果实的咖啡酸含量为红果时期＜黄果时期＜深红果时期＜青果时期，即从秋福红树莓果实中获得高含量的咖啡酸，可以选择青果时期进行采摘。

图7 秋福红树莓4个发育时期果实中的咖啡酸含量Fig.7 Caffeic acid content of Autumn Bliss red raspberry fruits in four development stages

2.8 不同成熟度秋福红树莓果实中总黄酮含量的比较

从图8 可以看出，总黄酮含量在5.93～13.66 mg∕g，从青果发育到深红果的过程中呈下降趋势，总黄酮含量最大的是青果时期（13.66 mg∕g），极显著（P＜0.01）高于黄果、红果、深红果，分别是其含量的1.8、1.9、2.3 倍。秋福红树莓果实的总黄酮含量为深红果时期＜红果时期＜黄果时期＜青果时期，即以秋福红树莓为材料获得高含量的总黄酮，采摘青果更好。

图8 秋福红树莓4个发育时期果实中的总黄酮含量Fig.8 Total flavonoids content of Autumn Bliss red raspberry fruits in four development stages

2.9 相关性分析

对秋福红树莓果实成熟过程中各酚类物质进行相关性分析发现（表5），鞣花酸和表儿茶素、咖啡酸、总黄酮含量之间，儿茶素和阿魏酸、表儿茶素、总黄酮含量之间，表儿茶素和芦丁含量之间均呈显著正相关；鞣花酸含量和芦丁含量之间，总黄酮和表儿茶素、芦丁含量之间均呈极显著正相关。以上酚类物质均在青果时期含量最高，所以若想获得高含量的以上某种或者几种酚类物质，采摘秋福红树莓的青果更好。水杨酸和阿魏酸含量之间呈显著负相关，水杨酸含量在红果时期最高，若想获得高含量的水杨酸，则采摘秋福红树莓的红果更好。

表5 秋福红树莓果实成熟过程中各指标间的相关性分析Tab.5 Correlation analysis of various indexes in the ripening process of Autumn Bliss red raspberry fruit

3 结论与讨论

红树莓在果实发育过程中，随着果实的成熟，酚类物质的含量不断发生变化。本研究表明，在秋福红树莓果实发育过程中，青果时期的鞣花酸和阿魏酸含量最大，为49.88 mg∕g 和0.53 mg∕g，分别是长营橄榄、檀香橄榄、灵峰橄榄[20]鞣花酸和阿魏酸含量的202.2 倍和9.0 倍、281.1 倍和7.2 倍、598.7 倍和12.2 倍，红树莓果实中的鞣花酸和阿魏酸含量远高于橄榄，说明秋福红树莓果实可作为一种良好的天然鞣花酸、阿魏酸来源进行开发；树莓果实中含有大量的水杨酸，深受人们的喜爱，有研究[18]发现秋福红树莓果实中提取的水杨酸可以抑制大肠杆菌和番茄灰霉病菌，本研究发现，秋福红树莓果实成熟过程中，水杨酸含量在红果时期最高，表明采摘红果时期的秋福红树莓果实提取水杨酸制备抑菌产品为宜；本研究结果显示，儿茶素、表儿茶素在果实发育过程中含量一直呈下降趋势，与东红猕猴桃[21]、绿宝石梨[22]果实的变化趋势均一致，即未成熟果的儿茶素、表儿茶素含量高于成熟果，说明采摘秋福红树莓青果提取儿茶素和表儿茶素物质更好，此结果与本课题组前期研究的菲尔杜德和托拉蜜红树莓品种的结果相似，青果时期的儿茶素和表儿茶素含量更高，且秋福品种含量高于菲尔杜德和托拉蜜品种[23]，秋福红树莓青果中表儿茶素含量大于儿茶素含量，与完熟期凯特、山农凯新2 号、红玉3 个品种杏果实中两物质含量对比一致[24]；秋福红树莓果实在发育过程中总黄酮的含量一直下降，这与红满堂、山定子、富士苹果[25]的变化趋势一致，均是未成熟果的总黄酮含量高于成熟果，与油柿果实的总黄酮含量变化相似，均为成熟初期大于成熟后期[26]，所以，选择秋福红树莓青果提取黄酮类物质更好。

综上所述，秋福红树莓果实的鞣花酸、阿魏酸、儿茶素、表儿茶素、芦丁、咖啡酸、总黄酮含量在青果时最大，水杨酸含量在红果时最大，可根据实际生产应用对红树莓进行适时采摘。本研究阐明了秋福红树莓中多种酚类物质在不同成熟度果实中的含量及变化趋势，为合理利用树莓资源提供了理论依据。