双歧杆菌、韦荣球菌、奈瑟氏菌生物学特点及其在低龄儿童龋发生发展中的作用和作用机制研究进展

林秀燕，石宏

1 河北医科大学口腔医学院，石家庄 050017；2 河北医科大学口腔医院儿童口腔科；3 河北省口腔医学重点实验室；3 河北省口腔疾病临床医学研究中心

低龄儿童龋（Early childhood caries，ECC）是临床最常见的儿童口腔疾病，其患病率高居儿童疾病的首位，是患病率第2 位的哮喘病的5 倍［1］。ECC 可导致儿童乳牙缺损、根尖周炎、乳牙滞留，影响恒牙的正常替换，严重者可引起全身其他器官的感染与损害，对儿童的身心健康造成极大危害。ECC 的发生发展可能与细菌、宿主、饮食等因素密切相关，口腔微生物群落的存在和生态失调可能在ECC 的发生发展中具有重要作用［2］。既往研究［3］认为，变形链球菌是龋病的主要致龋菌之一，在重度低龄儿童龋（Severe early childhood caries，SECC）的发生发展中发挥重要作用。然而基于传统致病菌的治疗未能有效降低龋病的发生率，可见以变形链球菌为主的单一致病菌理论无法完全反映口腔微生物在ECC 发生发展中的作用。最新研究［4］认为，龋齿并不是单纯由变形链球菌导致的，口腔微生物群落的整体平衡的改变导致龋齿的发生。有学者认为双歧杆菌、韦荣球菌及耐瑟氏菌是益生菌，可维持人体口腔健康；但部分学者认为，双歧杆菌、韦荣球菌及耐瑟氏菌具有一定致龋性，与ECC 的发生发展有关。目前，双歧杆菌、韦荣球菌及耐瑟氏菌在ECC 发生发展中的作用及作用机制已有部分研究报道。 现将双歧杆菌，韦荣球菌、耐瑟氏菌的生物学特点及其在ECC 发生发展中的作用及作用机制研究进展进行综述。

1 双歧杆菌生物学特点及其在ECC 发生发展中的作用和作用机制

1.1 双歧杆菌的生物学特点 双歧杆菌属［5］是一群具有多形态、无动力的革兰阳性无芽孢厌氧菌，其最适pH 值为6.5～7.0，最适生长温度为37～41 ℃，是一种耐酸微生物。该菌属首先从婴儿粪便中分离到，生化反应特征为过氧化氢酶阴性，具有Y 形特征，G+C含量高，双歧杆菌与绝大多数糖类的分解代谢途径不同，其主要依赖于果糖-6-磷酸解酮酶，而产物不生成二氧化碳、丁酸、丙酸，其主要代谢产物中的乳酸、乙酸以及少量的甲酸的等量比例会随菌株不同形成差异。双歧杆菌与肠壁相互作用维护肠道内生理环境，具有调节肠道微生物区系、产生抗菌物质、增强免疫系统等生理功能，被认为是人体益生菌［6-7］。迄今为止，已经分离鉴定的双歧杆菌（亚种）有88种，多数来自人类肠道和口腔、动物胃肠道［7-8］，比如栖牙双歧杆菌、齿双歧杆菌及殊形双歧杆菌主要在人体口腔中发现。细菌的产酸能力和耐酸性与龋病的发生密切相关，当口腔环境中pH 值小于5.5时，牙釉质开始脱矿。研究发现，双歧杆菌属里长双歧杆菌、动物双歧杆菌的产酸性最强，芽孢杆菌的产酸能力最低［8］，表明不是所有的双歧杆菌属均有强致龋性，不同菌株的致龋性不同，临床应寻找并阻断优势致龋菌株在牙面的定植，抑制ECC的发生发展。

双歧杆菌的常规鉴定和分类是基于其表型和生化特征，如菌群形态、革兰氏染色结果、生化反应等。随着分子生物学的发展，16S rRNA 可以从基因序列中得到不同种系发生水平的多个区域的特定基因信息，目前临床常用的双歧杆菌鉴定工具均基于16S rRNA 基因序列分析方法，如ARDRA、DGGE 及物种特异性引物PCR。有研究［9］采用从粪便中进行DNA 的宏基因组测序分析了双歧杆菌分类群在复杂细菌群落的相关性。纳米孔测序技术可用于新的物种鉴定及验证物种分配的局限性。ANGELL 等［10］使用六聚体频率和纳米孔测序数据的k均值聚类相结合识别了3 个月大婴儿肠道微生物群中的双歧杆菌属及与阴道分娩有关的双歧杆菌。说明双歧杆菌属是较早出现在肠道微生物群落中的，而口腔和肠道微生物之间存在相互作用的关系，肠道的菌群生态的组成和功能失调可能会导致口腔中有害菌的增殖，从而促进ECC 的发生发展。宏基因组霰弹枪方法可根据测序深度提供与特定生态系统相关的复杂微生物群落中存在的微生物的遗传信息，可识别一些尚未培养的新物种，有学者［11］应用宏基因组霰弹枪测序方法对动物肠道微生物群落中属于双歧杆菌属的新型肠道共生物种进行鉴定。

1.2 双歧杆菌在ECC 发生发展中的作用及作用机制 研究［12-13］研究了短期食用含乳双歧杆菌Bb12的益生菌对患龋风险个体唾液中变形链球菌计数的影响，结果发现唾液中变形链球菌计数显著降低，说明食用含有乳酸双歧杆菌Bb12 的益生菌酸奶可能会改变口腔生态环境。但肖小芬等［14］认为，双歧杆菌属在SECC 组口腔中的丰度较高，且与龋失补牙面数强正相关，其可能是儿童早期重度龋发生的指示菌属。有研究［15］采用qPCR 法对75例ECC儿童口腔中的双歧杆菌、变形链球菌、嗜酸乳杆菌等进行量化检测，发现双歧杆菌在牙本质龋患儿的口腔牙菌斑中检出率较高，说明双歧杆菌在牙本质龋进展中发挥了一定的作用。TANTIKALCHAN 等［16］通过收集122 例泰国2～5 岁无龋及SECC 儿童过夜的牙菌斑进行检测，发现双歧杆菌与龋均和牙龈指数相关，但在SECC 儿童牙菌斑中并未检测到该细菌。这表明双歧杆菌在ECC 进展中可能并不是最初的定植者之一，其可能具有促进或加速其他细菌在牙面定植及致龋作用。

SANTOS 等［17］发现动物芽孢杆菌和长芽胞杆菌与变形链球菌联合可促进不溶性胞外多糖的产生和龋损的进展，说明不同细菌在ECC 的发生、发展所起的作用不同，菌群之间可能发挥着相互协同或者拮抗的作用。双歧杆菌具有独特的代谢途径，即“双歧分流”，它可能通过增加产酸性而赋予其致龋潜力。MANOME 等［18］研究结果表明双歧杆菌能够在氟化物存在下代谢碳水化合物，在pH 值为7 时其产酸能力与pH 值为5.5 时一样高，表明双歧杆菌产酸能力强且具有很高的致龋潜力。通常细菌致龋能力包括它在牙面上的定植能力及其产酸和耐酸能力。虽然多数研究认为，双歧杆菌可促进ECC 的发生，但由于双歧杆菌无法在牙面大范围定植且多在胃肠道黏膜上黏附，及不同菌株之间如何互相作用从而影响ECC 致病程度，其在ECC 发生发展中的具体作用机制仍有待进一步深入研究。而目前生态菌斑学说被大家逐渐接受，其认为致龋微生物可作为口腔常居菌的一部分存在于牙菌斑生物膜中，因此在中性环境下，这些微生物并不在菌群中处于优势地位，在此生态环境中，牙面的脱矿和再矿化过程处于平衡状态。那么在双歧杆菌定植牙面、黏附、繁殖生长、最终在ECC 发生发展的过程中，其他微生物如变形链球菌等可能都有不同程度的参与，尽管其产酸能力可能有所差异，但在生态种群的改建中并不存在特异性的选择。

2 韦荣球菌属的生物学特点及其在ECC 发生发展中的作用和作用机制

2.1 韦荣球菌的生物学特点 韦荣球菌属［19］为0.3～0.5 μm 细小直径的革兰阴性球菌，呈双球状排列、不能运动、无芽孢形成、无荚膜及鞭毛，是绝对的厌氧菌，其作为共生微生物存在于人和动物的口腔、肠道以及生殖泌尿系统和呼吸系统中。韦荣球菌作为牙菌斑形成过程中的早期定植菌之一［20］，其丰度和多样性在口腔微生物中具有一定的比例，对口腔健康造成了影响。有研究［19］表明在韦荣球菌属的14 种中，不典型弧菌、牙癣弧菌、小弧菌、罗戈弧菌、散叶弧菌、婴儿弧菌和托贝苏氏弧菌已在人类唾液或舌或牙齿生物膜中被发现，它们构成了在龈上、龈下牙菌斑以及口腔粘膜菌群重要组成部分。

韦荣球菌在属水平上相对容易识别，但在种水平上仍然难以识别，因为没有有用的表型或生化检查来区分它们。基于16S rRNA 基因测序的分子方法，包括PCR-RFLP，通常用于鉴定韦荣球菌种水平的菌株，但因为韦荣球菌高度保守的基因序列及其染色体内一致性相对较高，目前较多使用如rpoB、dnak、gltA 等管家基因对其物种进行辨别［21］。MASHIMA 等［22］学者通过采集89例泰国儿童舌部生物膜样本，使用了一种新的基于rpoB 基因序列的物种特异性引物的一步法PCR 方法进行检测，这种方法能够清楚地区分基于DNA-DNA 同源性定义良好但基于16S rDNA定义较差的物种。结果显示，89例受试者中仅有10 例分离到101 株韦荣球菌属细菌，对6 种韦荣球菌的rpoB 基因进行相似性搜索，发现所有受试者的rpoB基因在2 500～3 100位具有高度多态性。尽管新证实的这40 个菌株目前已经不能被归类为任何已经建立的口腔韦荣球菌属，但说明其他韦荣球菌物种也有可能栖息于口腔环境中。目前也有基于16S 核糖体DNA 基因测序的分子方法，包括PCR 随机片段长度多态性分析，用来在物种水平上鉴定韦荣球菌菌株［23-24］。然而，关于口腔韦荣球菌的鉴定和分布的研究是有限的，因为该细菌群落可能受到地理位置、年龄、饮食、生活方式、社会经济地位和口腔卫生状况差异的影响。

2.2 韦荣球菌在ECC 发生发展中的作用及作用机制 韦荣球菌属被认为是存在于人类口腔和胃肠道中的共生菌，因为它是核心微生物组的一部分。以往有研究［25］显示，韦荣球菌因其利用乳酸而非碳水化合物作为能量来源、升高pH的特性以及减少产酸菌的致龋作用被认为是防龋的益生菌。WANG等［26］通过单分子实时测序表征3～5 岁儿童龋齿中的口腔微生物群，结果发现韦荣球菌可能与健康的口腔微生物生态系统有关。但有研究［25］表明，韦荣球菌与变形链球菌存在着密切的共生关系。其可能有助于提高变形链球菌的群体竞争力，在适当致龋环境存在时，促进微生态向致病性转化，可能与ECC的发生发展存在协同作用。可见，韦荣球菌与ECC之间究竟存在何种关系目前尚不清楚，其可能是由于不同细菌物种在ECC 的发展中扮演着不同的角色。以往有研究认为在口腔生物膜形成过程中，韦荣球菌是早期定植菌，但其如何在龋病早期阶段发挥致龋作用仍需更深入的研究来了解其具体机制。QUDEIMAT 等［23］采用第二代测序技术对128 例儿童牙菌斑进行测序，结果表明细小韦荣球菌在龋齿活跃的儿童中相对丰度较高并占主导地位。一项为期2 年的纵向研究［27］结果表明，小韦荣球菌可作为ECC 发病风险的生物标志物，其在ECC 发生发展中具有一定的作用。变形链球菌作为口腔中常见的致龋菌之一［4］，致龋性取决于其产酸性和耐酸性，能够迅速发酵多种碳水化合物产生大量酸，使局部pH下降至5.5以下，促进菌斑的形成。LIU等［28］研究表明变形链球菌在与韦荣球菌共同培养时，双菌种生物膜中变形链球菌的数量较单独培养时增加，而在多菌种生物膜中，仍可见韦荣球菌对变形链球菌的协同促进作用。韦荣球菌只在有链球菌存在时生长，链球菌发酵碳水化合物产生的有机酸可作为韦荣球菌的碳源，韦荣球菌不能直接代谢糖类，具有把代谢较强的、非挥发性的乳酸转化成为较弱的、挥发性的乙酸和丙酸的能力。酸和丙酸的能力。链球菌为韦荣球菌提供黏附位点和营养来源，而韦荣球菌可促进链球菌生长和生物膜抵抗能力。韦荣球菌作为口腔微生物中高丰度菌属之一，其高耐酸能力及在牙菌斑形成中的作用，提示韦荣球菌在致龋过程中的地位不可忽视，但其在ECC发生中的机制作用尚不明确。

3 奈瑟氏菌属生物学特点及其在ECC 发生发展中的作用和作用机制

3.1 奈瑟氏菌的生物学特点 奈瑟氏菌［29］为直径0.6～1.0 μm 的需氧革兰阴性球菌，单个或成对排列，且相邻的一面扁平，按彼此互相垂直的两个平面分裂，有时导致四联球菌，不形成内生芽孢，无鞭毛但可有纤毛，不运动，其最适生长温度为35～37 ℃，对干燥敏感，初次分离需要湿度。口腔奈瑟氏菌需氧酶和过氧化氢酶均为阳性，产生H2S，亚硝酸盐还原阳性。奈瑟氏菌属是一类β 变形杆菌，是人和动物的专性共生体，至少有8 种共生奈瑟氏菌在人类黏膜表面定居［30］，人体内发现的奈瑟氏菌有淋球菌、脑膜炎球菌、解乳糖奈瑟氏菌、干燥奈瑟氏菌、微黄奈瑟氏菌、金黄奈瑟氏菌、黏液奈瑟氏菌等，正常人口腔中常见者为干燥奈瑟氏菌、微黄奈瑟氏菌和黏液奈瑟氏菌［29］。其在出生一周的新生儿口腔中无法检测到，但到八个月后，几乎所有婴儿口腔中均能检测到该菌，7～12 岁儿童中80%唾液内可检到奈瑟氏菌，为唾液中数量仅次于α—溶血性链球菌的细菌，约为5×106/mL。

传统的奈瑟氏菌表型分类法可鉴别出脑膜炎奈瑟菌、淋球菌和乳链球菌，但此方法对于定义和识别其他奈瑟氏菌相关物种具有一定的难度［31］，因此诸如DNA-DNA 杂交和16S 核糖体基因的核苷酸序列数据的系统发育分析等分子方法的应用解决了该问题，基于多基因座序列分析的系统发育，导致了一些奈瑟氏菌属的重新分类，将其合并为亚黄酮亚变种、全黄菌和黄奈瑟氏菌。也有研究报道可利用16S rRNA 基因的高通量测序和元基因组学来鉴定奈瑟氏菌与龋病相关的潜在属［32］。

3.2 奈瑟氏菌在ECC 发生发展中的作用及作用机制 奈瑟氏菌为儿童出生后口腔的首批定植者，被证明是来源于健康个体的早期生物膜内细胞-细胞相互作用的重要介质，其可能在维持与健康相关的口腔微生物组中发挥关键作用［33］。LEE 等［34］采集120 例韩国12 岁以下儿童的唾液和牙菌斑样本，用Illumina HiSeq 测序鉴定其口腔细菌组成，结果发现：6 岁以下无龋儿童牙菌斑中口腔奈瑟氏菌含量较高，奈瑟氏菌与ECC 可能并无明显的相关性。对健康儿童口腔正常菌群的研究也发现，在唾液、菌斑窝沟、龈上菌斑、龈下菌斑中，奈瑟氏菌的检出率为100%。但XIAO 等［32］学者通过收集96 例3～6 岁无龋、ECC、SECC 儿童的牙菌斑，利用16S rRNA 基因的高通量测序和元基因组学鉴定，表明杆状奈瑟菌ATCC BAA-1200 菌株在儿童龋病的发生发展过程中起着非常重要的作用，其与龋失补牙面数及葡萄糖相关代谢途径呈正相关，具有发酵产酸能力。奈瑟氏菌在SECC 儿童唾液微生物群中丰度最高，但也有表明低龋齿经历的健康儿童与奈瑟氏菌属、嗜血杆菌属和梭杆菌属的丰度较高有关，而这些属中的大多数物种仅轻微发酵蔗糖，可见不同的奈瑟氏菌菌株与ECC 的相关性并不完全一致，一些特异性菌株可能具有较强的产酸性和耐酸性，在ECC 的进展中存在潜在的致龋性。

奈瑟氏菌在牙菌斑生物膜中的作用表现为对牙表面黏附能力很弱，但却是与血链球菌一起最早定植于干净牙面的细菌［35］，其主要存在于菌斑外层和早期菌斑中，可能因为奈瑟氏菌是需氧菌，菌斑早期的高氧压有利于它生长，而随着菌斑的成熟，氧压降低，奈瑟氏菌数量也减少。奈瑟氏菌在分解各种糖时会形成数量不等的酸，其中分解麦芽糖产生的酸最多，且各种奈瑟氏菌产酸的能力也不同，产生酸类最强的是干燥奈瑟氏菌，其次是微黄奈瑟氏菌。干燥奈瑟氏菌在含蔗糖的培养基中产生的多糖荚膜能使无荚膜的细菌聚集，并且这种聚集不因葡聚糖的消化而分解，荚膜还可被其他微生物的生长所利用，促进菌斑形成。微黄奈瑟氏菌中的深黄奈瑟氏菌在含蔗糖的培养基中能产生大量支链淀粉，比蔗糖还容易迅速被链球菌和乳杆菌所利用。有研究发现脑膜炎奈瑟氏菌可以利用乳酸，从牙菌斑中分离的奈瑟氏菌菌株也已被证明能将乳酸降解为醋酸，表明奈瑟氏菌具有双向作用，在有蔗糖的条件下可合成胞外多糖并可酵解糖，其具有代谢葡萄糖、产生有机酸的能力，在糖缺少或无糖时，奈瑟氏菌可降解菌斑中产酸菌所产生的乳酸成为弱酸和挥发性酸，其又有利用乳酸的能力［36］。可见奈瑟氏菌在口腔中的扮演的角色是是复杂的，其在低龄儿童致龋过程中所发挥的作用仍然未知，因此未来对奈瑟氏菌的深入研究具有一定的必要性。

综上所述，ECC 是一种慢性感染性疾病。口腔中部分细菌如双歧杆菌、韦荣球菌、奈瑟氏菌与ECC的发生发展有关。产酸性较强的双歧杆菌可导致牙釉质脱矿，促进或加速其他口腔致病菌在牙面的定植，促进ECC 的发生发展。韦荣球菌是牙菌斑形成过程中的早期定植菌之一，促进口腔致病菌变形链球菌的生长，提高变形链球菌的生物膜抵抗能力，促进ECC 的发生发展。奈瑟氏菌是人体口腔的常见菌，是生物膜内细胞—细胞相互作用间的重要介质，可能通过发酵产酸途径促进ECC 的发生发展。龋易感儿童非致龋性菌斑转变为致龋性菌斑的过程中口腔微生物的生理结构、数量种类的变化仍然未知，且细菌酸碱代谢与基于16S 的物种分配的关系似乎也很复杂，但是随着分子生物学及其技术的不断发展，在未来的研究中，对整个基因组进行功能描述的元基因组方法、多组学联合应用等将有助于阐明龋病的微生物发病机制，更好地为ECC 的预防及微生物靶向阻断提供科学依据。