喀什地区林奇综合征错配修复蛋白检测分析

朱君玲，姜会娟，韩雯，李玉华

结直肠癌发病机制与遗传因素和环境因素密切相关［1］。研究认为，白种人结直肠肿瘤的发生率更高［2］。也有研究发现，哈萨克族因其饮食习惯导致结直肠癌发生率较高［3］，而南疆地区大多数为维吾尔族，具有白种人血统且以肉食为主，导致其结直肠癌发病率较高。林奇综合征作为一种遗传性结直肠癌，同系家族发生率较高。其错配修复（mis‑match repair，MMR）蛋白包括MutL 同源物 1（hu‑man mutL homolog 1，MLH1）、MutS 同源物2（MutS homolog 2，MSH2）、PMS1 同源物2（PMS1 homolog 2，PMS2）、MutS 同源物6（MutS homolog 6，MSH6），可修复脱氧核糖核酸（DNA）错配碱基对，发挥修复基因损伤作用，而MLH1、MSH2、PMS2、MSH6 功能异常可增加结直肠癌发生率［4-5］。本研究旨在分析喀什地区林奇综合征患者MLH1、MSH2、PMS2、MSH6 蛋白的表达情况。

1 对象与方法

1.1 研究对象

收集2016 年6 月至2020 年6 月在喀什地区第一人民医院接受手术的300 例林奇综合征患者的标本。300 例林奇综合征患者中男性178 例，女性122 例；年龄21～92 岁［（56.11 ± 10.78）岁］；肿瘤部位：左半结肠癌97 例，右半结肠癌78 例，直肠癌125 例；肿瘤大小：≥5 cm 142 例，<5 cm 158 例；分化程度：低分化91 例，中分化99 例，高分化110 例；肿瘤形态：溃疡型186 例，隆起型114 例；浸润程度：浆膜外142 例，浆膜内158 例；有神经侵犯72 例，无神经侵犯228 例；有脉管侵犯75 例，无脉管侵犯225 例；有淋巴结转移64 例，无淋巴结转移236 例。纳入标准：（1）符合《遗传性结直肠癌临床诊治和家系管理中国专家共识》［6］中关于林奇综合征的诊断标准；（2）经病理学检查确诊；（3）均行肠癌根治术；（4）均为维吾尔族；（5）临床资料完整。排除标准：（1）腹膜转移或远端转移；（2）活检标本；（3）合并恶性肿瘤；（4）有严重肝肾疾病；（5）术前接受化疗及放疗。本研究经医院医学伦理委员会审核批准［2018 快审第（105）号］。

1.2 方法

1.2.1 MMR 蛋白检测 采集患者手术切除的组织标本，使用4%的中性甲醛固定，石蜡包埋，切片。采用免疫组化法检测MLH1、MSH2、PMS2、MSH6 蛋白表达水平，按试剂盒说明书操作，抗体及试剂盒来自北京中杉金桥生物技术有限公司，阴性对照采用磷酸盐缓冲液，阳性对照采用正常结直肠黏膜上皮细胞。细胞核内有棕黄色或黄褐色颗粒判定为阳性，否则为阴性。MLH1、MSH2、PMS2、MSH6 蛋白中任一蛋白表达为阴性即判定为错配修复蛋白缺失（deficient mismatch repair，dMMR），全部阳性判定为错配修复蛋白完整（proficient mismatch re‑pair，pMMR）。根据林奇综合征患者MMR 蛋白表达缺失情况将其分为dMMR 组和pMMR 组。

1.2.2 资料收集 收集患者性别、年龄、肿瘤部位、肿瘤大小、分化程度、肿瘤形态、浸润程度、神经侵犯、脉管侵犯、淋巴结转移等临床资料。

1.2.3 随访及预后分析 术后对dMMR 组和pMMR 组患者随访观察2 年，每3 个月电话、门诊、复查随访1 次，记录其生存情况。

1.3 统计学处理

应用统计学软件SPSS 22.0 处理所得数据，计数资料以百分比（%）表示，采用χ2检验。计量资料以±s表示，采用t检验。采取Kaplan‑Meier 法行生存分析。P<0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 林奇综合征患者MMR 蛋白表达情况

300 例林奇综合征患者中，dMMR 发生率为16.67%（50/300），pMMR 发生率为83.33%（250/300），其中MLH1 蛋白表达缺失率为3.67%（11/300），MSH2 蛋白表达缺失率为8.00%（24/300），PMS2 蛋白表达缺失率为3.00%（9/300），MSH6 蛋白表达缺失率为2.00%（6/300），MLH1 和PMS2 蛋白表达缺失率为6.00%（18/300），MSH2 和MSH6蛋白表达缺失率为5.67%（17/300），MLH1、MSH2、PMS2、MSH6 蛋白同时表达缺失率为1%（3/300）。根据林奇综合征患者MMR 蛋白表达缺失情况将其分为dMMR 组（n=50）和pMMR 组（n=250）。

2.2 MMR 蛋白表达缺失与林奇综合征患者病理特征的关系

dMMR 组与pMMR 组患者性别、年龄、肿瘤大小、肿瘤形态、神经侵犯、脉管侵犯、淋巴结转移比较差异无统计学意义（P>0.05）；dMMR 组患者肿瘤在右半结肠、分化程度低、浸润至浆膜外中的占比高于pMMR 组（P<0.05）。见表1。

表1 MMR 蛋白表达缺失与林奇综合征患者病理特征的关系［例（%）］

2.3 dMMR 组与pMMR 组患者生存率比较

在术后2 年的随访观察中，dMMR 组有10 例失访，pMMR 组有17 例失访，dMMR 组2 年生存率为87.50 %（35/40），pMMR 组2 年 生 存 率 为72.10 %（168/233）。Kaplan‑Meier 生存分析显示，dMMR 组和pMMR 组患者的2 年生存率比较差异有 统 计 学 意 义（Log Rank=5.156，P=0.023）。见图1。

注：dMMR 为错配修复蛋白缺失，pMMR 为错配修复蛋白完整

3 讨论

结直肠癌为消化道常见的恶性肿瘤。随着生活方式和饮食方式的改变，结直肠癌的发病率及死亡率呈逐年上升趋势，严重威胁着患者的生命健康［7］。结直肠癌临床表现不明显，早期患者无明显症状，发现时往往处于肿瘤晚期，导致其预后较差［8］。目前放化疗、手术治疗、靶向治疗等治疗方法可延长患者生存期及改善生存质量，但某些患者对目前的治疗方式存在不敏感现象，故结直肠癌治疗靶点及有效性筛查对提高其诊疗精准性具有重要价值［9］。结直肠癌根据发病特点可分为散发性和遗传性，林奇综合征是遗传性结直肠癌中较为特殊的一种类型，为MMR 蛋白突变而形成的一种显性遗传性疾病。目前通过MMR 蛋白检测可发现dMMR而确诊林奇综合征，有助于家族遗传筛查［10］。目前临床上主要采用免疫组织化学法和聚合酶链式反应检测MMR 蛋白表达情况，前者检测简单快捷，后者为MMR 蛋白检测的金标准，能够更加客观地评估功能性dMMR，但是对实验室条件要求高且价格相对昂贵。随着科学技术的发展，二代测序是近年来出现的新的检测方法。早期应用免疫组化分析MMR 蛋白的研究主要集中在MLH1 和MSH2 上，但研究显示其在筛选林奇综合征患者时敏感度和特异度不高，检测MLH1 和MSH2 蛋白无法完全预测林奇综合征的基因突变［11］。随着研究的进展，MLH1 和MSH2 蛋白联合PMS2 和MSH6 蛋白检测可有效提高MMR 蛋白的预测价值，与微卫星不稳定性检测效果相当［12］。吴畅等［13］在对湖南地区的MMR 蛋白表达的研究中发现，MLH1、MSH2、PMS2、MSH6 蛋白表达缺失率分别为8.90%、2.60%、14.70%、2.60%；在欧洲的一项研究中，MLH1、MSH2、PMS2、MSH6 蛋 白 表 达 缺 失 率 分 别 为15.00%、21.00%、15.00%、13.00%［14］；而韩国的一项研究中，MLH1、MSH2、MSH6 蛋白表达缺失率分别为3.70%、2.00%、5.20%［15］。目前报道的MMR蛋白缺失率与本研究结果存在一定差异，表明dMMR 可能和生活方式、病理特征、遗传及地理等因素有关。本研究中MLH1 和PMS2 蛋白表达缺失率为6.00%，MSH2 和MSH6 蛋白表达缺失率为5.67%，MLH1、MSH2、PMS2、MSH6 蛋白同时表达缺失率为1%，说明MLH1 和PMS2、MSH2 和MSH6蛋白可能存在共同缺失的情况，分析原因可能是有多个分子和酶参与MMR 蛋白修复DNA 的过程，MLH1 和MSH2 蛋白通过与同源性MMR 蛋白形成二聚体发挥主要作用，MLH1 和PMS2、MSH2 和MSH6 蛋白之间能够分别合成功能性二聚体复合物。MLH1 和MSH2 蛋白属于主导蛋白，PMS2 和MSH6 蛋白属于配对蛋白，MLH1 和MSH2 蛋白发生突变后二聚体蛋白降解，从而使MLH1 和PMS2、MSH2 和MSH6 蛋白表达缺失［16］。

在分析MMR 蛋白表达缺失与林奇综合征患者病理特征的关系时发现，2 组患者性别、年龄、肿瘤大小、肿瘤形态、神经侵犯、脉管侵犯、淋巴结转移比较差异无统计学意义，说明MMR 蛋白突变发生在肿瘤的早期阶段，与上述病理特征没有显著相关性。而右半结肠癌患者dMMR 的发生率更高，考虑可能与生理功能、胚胎来源及血管供应等生物学和临床差异有关［17］。左半结肠癌与右半结肠癌的发生发展本身不太一样，右半结肠毛细血管丰富、血液供应充足，同时肠腔较左半结肠大，壁薄扩张、离子交换、基因突变都更容易［18］。dMMR 患者肿瘤分化程度更低，说明中低分化的肿瘤更容易出现dMMR，导致错配概率增加，加速癌细胞增殖分裂，从而加剧肿瘤恶化。dMMR 与肿瘤浸润程度也有一定关系，PMS2 蛋白缺失的患者浸润至浆膜外更多，可能是因为癌组织侵犯范围增加，导致MMR 蛋白缺失增多，肿瘤的发展更加严重。但也有研究显示［19-24］，dMMR 与性别、肿瘤大小、淋巴结转移等有一定关系，与本研究结果存在一定差异，考虑可能与选取的样本间差异有关。另外，本研究显示，dMMR 患者的生存率显著高于pMMR 患者，与赵辉等［25］的研究结果较为一致，但现阶段关于MMR 蛋白影响患者预后的具体机制尚不清楚。本研究中dMMR 患者预后较好，推断可能与肿瘤组织中二氢嘧啶脱氢酶和胸苷合成酶过表达及免疫监视功能增强有关。

综上所述，MMR 蛋白与林奇综合征的发生发展密切相关，林奇综合征患者中常见MMR 蛋白缺失，检测MMR 蛋白能够早期诊断dMMR，对林奇综合征进行预测，在患者治疗方案的选择及预后分析中有着重要意义。