腌制芥菜细菌多样性的分析及优势乳酸菌的筛选与鉴定

唐睿，邓放明，赵艳玲，田艳

（1.新疆理工学院，新疆 阿克苏 843100；2.湖南农业大学，湖南 长沙 410125）

腌制芥菜是我国传统美食之一，新鲜芥菜的叶、茎和根均可作为发酵原料[1]，经发酵加工制成的芥菜口感鲜爽脆嫩，具有增强肠胃消化、提高食欲的功能，深受大众喜爱[2]，其中比较典型的加工产品有榨菜、酸菜、泡菜等[3]。芥菜在高盐腌制过程中，其含有的硫代葡萄糖苷被水解，产生挥发性芥子油、硫酸氢钾等物质，使其具有独特风味[4-5]。此外，腌制芥菜在一定程度上延长了产品的货架期。

芥菜传统的发酵工艺比较简单，将新鲜的芥菜切碎，适当烘干，添加适量的盐和香料，随后放入发酵罐进行发酵，使芥菜在复杂的环境下不断发酵。由于各地区采用的原料品种和生产工艺不同，所以产品的口味、储存周期等都具有一定的差异[6]。芥菜腌制过程中起主要作用的是盐和微生物，在高盐腌制的作用下，细胞内的盐浓度与细胞外的盐浓度需要达到渗透压平衡[7]，造成细胞水分流失，使芥菜组织紧密，从而达到延长产品保质期的目的。细胞脱水会导致细胞破裂，芥菜细胞破裂后，其细胞内的营养物质不断流出，芥菜上的微生物可以利用这些物质进行繁殖[8]。在一定的条件下，微生物会将原料中的大分子物质降解为一些小分子物质，这些物质可以使产品产生独特的风味，还有益于身体健康。王一淇等[9]对湖南芥菜腌制发酵过程的研究表明，不管是在芥菜发酵的初始阶段还是在后期，乳酸杆菌都是芥菜发酵中最为主要的优势菌。除此之外，泡菜在经过发酵处理之后，可以产生大量的益生菌，使其表现出抗氧化特性[10]。

目前，对发酵芥菜的研究侧重于减少发酵芥菜中含盐量[11]、芥菜的品质研究[12]、芥菜工艺的改良[13]、香气成分探究[14]以及传统微生物分离培养[15]方面，而对于发酵芥菜中微生物多样性的研究较少。随着微生物探究技术的不断发展，高通量测序技术（high-throughput sequencing，HTS）的出现使传统的生物学领域出现了巨变，可以广泛应用于多种组学中。如对大部分微生物类群进行精准识别，拓宽微生物研究范围。除此之外，多样性的测序方法还常被运用于探索环境微生物与人类微生物生态系统的多样性分析中[16]，如今已逐渐演变为评析微生物多样性的一种常用技术[17-19]。因此，采用高通量测序法测定16Sr DNA 中的V4 区域，从门、属水平分析不同含盐量的天然发酵芥菜的菌落组成和相对含量，确定腌制芥菜发酵后的优势菌，比较3 种不同发酵工艺和不同含盐量的发酵芥菜的细菌菌落组成和相对含量的差异，并对优势乳酸菌进行分离鉴定，旨在探究不同发酵工艺和不同含盐量的腌制芥菜对微生物区系结构带来的影响，同时寻找适合直投式发酵芥菜且能工业化生产的优势菌株，以期为芥菜发酵工艺生产提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

腌制芥菜：采集于湖南岳阳；乳酸细菌培养基（MRS）：广东环凯微生物科技有限公司；DNA 抽提试剂盒：美国奥美嘉生物技术公司；西班牙琼脂糖：北京艾普立邦科技有限公司；琼脂糖凝胶回收试剂盒：美国爱思进公司；高保真DNA 聚合酶:北京全式金生物技术股份有限公司。

1.2 主要仪器与设备

雷磁PHSJ-3F 型pH 计：上海仪电科学仪器股份有限公司；UV759 型紫外线可见分光光度计：深圳市三莉科技有限公司；illumina MiSeq 台式DNA 测序仪：因美纳科学器材有限公司；2720PCR 型扩增仪、NC2000 Nanodrop 型超微量分光光度计：赛默飞世尔科技有限公司；FLX800T 型酶标仪：美国伯腾仪器有限公司；DYY-6C 型电泳仪：北京六一生物科技有限公司；QL-901 型旋涡混合机：海门其林贝尔仪器制造公司；Quantus Fluorometer 型微量荧光计：普洛麦格（北京）生物技术有限公司；BJPX-400-II 型微生物恒温培养箱：山东博科医疗器械有限公司；FastPrep-24 5G 型研磨仪：北京毕特博生物有限公司；5424R 型高速台式冷冻离心机、N13462C 型移液器：艾本德国际贸易有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 样品采集和预处理

将采集的3 种腌制芥菜进行编号：A 组为岳阳华容县密封池腌制的芥菜，含盐量16%；B 组为岳阳华容县大坛腌制的芥菜，含盐量10%；C 组为岳阳君山区发酵坛腌制的芥菜，含盐量5%。在无菌环境下，将腌制芥菜剪碎处理成长宽约为0.5 cm 的样品，分别放入塑封袋和冻存管中保存备用，塑封袋置于4 ℃冷藏，冻存管于-80 ℃储存。

1.3.2 基于16S rDNA 的V4 区的高通量测序分析腌制芥菜中的微生物组成

对3 组腌制芥菜样本中的全部DNA 进行提取，随后进行16S rDNA 在V4-V5 可变区的聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增,再用正向引物对菌株16S rRNA 基因组完成PCR 扩增,其正、反向的引物序列为338F（5'-baRcode+ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3'）、806r（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）。将对检测样品中的特异的7-bp 条形码融合在引物上,实现多重检测。

1.3.3 统计分析

通过FASTP 程序和FLASH 软件对原始测序序列进行质量管理和拼接,对尾部平均质量值小于或等于20 的碱基进行筛选和读取，并建立门户。一旦窗口的平均质量值小于20，则截取其后端碱基，并过滤小于50 bp 的读取片段，剔除含有N 个碱基的读取片段；成对的片段拼接根据PE 阅读片段间的重复情况而定，最少重复长度为10 bp 的序列；0.2 的拼接顺序根据重叠范围的最大程度规定错配数，以便筛查出不合格的序列；区分样本的排序序列则依据在顺序开端和终点上的条形码和引物来确定。

找出所需要的数据序列后根据优化的序列进行常规研究，最后通过Uparse 程序，按照97%的相似率对相关数据进行聚类，从而研究数据的Alpha 多样性。然后通过分类学对从门到属的生物种类进行研究，从而获取分类学资料，并从门和属的层次上计算样本的种群组成。

1.3.4 优良乳酸菌菌株的筛选

对腌制芥菜样品取样，进行梯度定量稀释（10-2、10-3、10-4），从以上每个梯度的稀释样品中取1 mL 样品稀释液均匀涂布于MRS 固体培养基上，37 ℃培养24～48 h。挑选单个菌落，在MRS 液体培养基中培养24 h，在MRS 固体培养基重复划线3 次以上，直至油镜下菌落形态一致，记录其菌落形态，对已纯化过的菌株进行过氧化氢酶试验和革兰氏染色试验，将过氧化氢酶阴性，而革兰氏酶染色试验阳性的菌株暂定标记为筛选出来的乳酸菌株并编号。

将细菌的产酸能力和耐盐能力作为对细菌的主要筛选指标，筛选出优良菌株。利用pH 计对发酵芥菜发酵液的pH 值进行检测，每组样品做3 次平行。耐盐能力的测定：分别在盐浓度为4%、6%、8%、10%、12%、14%、16%的盐水中加入新筛选出的单个菌种，在培养箱中发酵48 h 后，用紫外线可见分光光度计在波长600 nm 处测量菌体密度，并将每个样品做3 次平行。对已筛选出的优势菌株开展生理生化试验，具体方法参考文献[20]。

1.3.5 优良菌种的16S rDNA 鉴定

对初步筛选出来的优势菌株进行基因载体DNA提取，再进行16S rDNA 基因序列的PCR 扩增。利用正向引物515F（5'-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3'）和反向引物907R（5'-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3'）进行扩增，对两个扩增步骤完的序列进行1%琼脂糖凝胶的毛细管电泳检验。使用DNA 测序仪对其进行最后提纯，制出相应的PCR 标记产物来完成DNA 测序。将已测序菌株的16S rDNA 顺序与NCBI 中的blast 相似的同源序列加以对比，可以确定带有较高同源性的模型菌株中的16S rDNA 序列，并通过mega-6.0 程序绘制菌株种源关系发育树。

2 结果与分析

2.1 腌制芥菜样本中的细菌群落高通量测序分析

2.1.1 基于OTUs 聚类

样品OTUs 分布韦恩图如图1 所示。

图1 3 个样品OTUs 聚类Fig.1 OTUs of three samples

由图1 可知，A、B 两组腌制芥菜样品的OUTs 数量明显高于C 组，说明含盐量较高的腌制芥菜的细菌数量比含盐量较低的腌制芥菜的细菌数量要多；B 组样品的OTUs 数量高于A 组，说明含盐量适中的腌制芥菜样品其细菌数量最多。A、B、C 3 组腌制芥菜样品中高相似度的OTUs 有375 个，分别占A、B、C 3 组样品OTUs 数量的37.39%、36.66%、44.17%，这些微生物对芥菜发酵益处较大，不同样本之间细菌群落组成既存在差异又有相似性。

2.1.2 Alpha 多样性分析

3 个样品的多样性指数见表1。

表1 多样性指数Table 1 Alpha diversity indexes

由表1 可知，A、B、C 覆盖率都大于0.99，说明腌制芥菜中几乎所有细菌群落的类型都得到了覆盖。A、B、C 3 组样品的Chao 值分别为778.13、762.80、530.21，Chao 值越大其丰富度越高，由此可见，A 组样品的细菌丰富度略大于B 组样品，C 组样品细菌丰富度最低；A、B、C 3 组样品的Shannon 值分别为3.33、3.12、4.16，Shannon 值越高表明其多样性越高，结果表明，细菌多样性排序为C＞A＞B。

2.1.3 基于门水平的细菌群落多样性分析

基于门水平的细菌构成及其分析结果如图2 所示。

图2 基于门水平的相对含量Fig.2 Relative abundance of different phyla

由图2 可知，在3 个发酵微生物组中的所有基于门水平上的菌落系统组成中，厚壁菌门、放线菌门、变形菌门、拟杆菌门是其中主要优势菌门，其余菌门的相对含量较少。在A 组中，相对含量较高的主要是厚壁菌门（62.94%）、放线菌门（18.15%）、变形菌门（12.37%）、拟杆菌门（3.83%），这4 个主要优势菌门相对含量共占细菌总量的97.29%；在B 组中，相对含量较高的是厚壁菌门（63.99%）、放线菌门（16.57%）、变形菌门（13.24%）、拟杆菌门（3.76%），这4 个优势菌门相对含量共占细菌总量的97.56%；在C 组中，相对含量较高的是变形菌门（45.61%）、拟杆菌门（29.37%）、厚壁菌门（16.67%）、放线菌门（5.36%），这4 个优势菌门相对含量共占细菌总数的97.01%，除此之外，C 组的蛭弧菌门占比也较高,相对含量为2.02%。

在门水平上，A、B 两组样品的细菌菌落组成相似，与C 组样品的细菌菌落组成相差较大，厚壁菌门的菌落相对含量低于A、B 两组，但变形菌门、拟杆菌门、蛭弧菌门的占比要远远高于其他两组样品。这可能是因为C 组样品含盐量较低，加盐发酵后能存活的细菌种数较多，因此其细菌多样性比A、B 组要高。

2.1.4 基于属水平的细菌群落多样性分析

基于属水平的细菌构成及其分析结果如图3 所示。

图3 基于属水平的相对含量Fig.3Relative abundance of different genera

如图3 所示，基于属水平上菌落组成中3 组样品的乳杆菌属、棒杆菌属、短杆菌属、不动杆菌属、盐单胞菌属都是重要的优势菌种属，但在含量构成上存在显著不同。在A 组中，占比相对较多的是乳杆菌属（38.20%）、片球菌属（16.94%）、棒杆菌属（12.01%）、短杆菌属（1.78%）、盐单胞菌属（1.78%）、考克氏菌属（2.54%），占总量的73.25%。在B 组中，占比较多的种类主要乳杆菌属（53.17%）、棒状杆菌属（6.72%）、短杆菌属（3.89%）、不动杆菌属（1.72%）、盐单胞菌属（2.02%）、考克氏菌属（2.02%）、芽孢杆菌属（2.16%），占总量的71.70%。在C 组中，占比较多的有不动杆菌属（16.41%）、乳杆菌属（10.41%）、类香味细菌属（11.30%），占总量的38.12%，除此之外，占比较高的还有稳杆菌属（9.53%）、Fluviicola（4.65%）、丛毛单胞菌属（4.3%）、短波单胞菌属（3.35%）、寡养单胞菌属（3.47%）、假单胞菌属（2.48%）、气单胞菌属（2.11%）、嗜冷杆菌属（2.17%）。

曾维友等[21]通过传统分离培育的方法，对自然发酵样品中的乳酸菌进行分离培育，并利用16S rDNA同源性序列分析筛选出了消化乳杆菌、植株乳杆菌、发酵乳杆菌、棒状乳杆菌、有害片球菌，且植株乳杆菌和发酵乳杆菌都是重要的优势菌种。肖甜甜等[22]利用高通量测序的方法对贵州苗家白酸汤样本的微生物多样性进行研究，发现优势菌属为乳杆菌属、醋酸杆菌属。张奶英等[23]利用变性梯度凝胶电泳技术对叶用芥菜盐渍发酵过程中的细菌多样性进行了研究，并通过对获得的网络变性梯度凝胶电泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）图谱进行解析，发现叶用盐渍芥菜的优势菌属为盐单胞菌属、嗜盐乳酸菌属、泡菜乳酸菌属、色盐杆菌属。此结果表明，在发酵芥菜的过程中优势细菌种属主要是乳酸杆菌属，与本试验结果相似，但在种水平上具有相当的差异，而产生这些差别的因素可能与发酵环境、发酵工艺、含盐量以及原材料等因素有关。

在3 组腌制芥菜样品中，含盐量较低的C 组所含属远远多于其他两组。这是因为高盐抑制了大多数细菌的生长，导致许多不耐盐的细菌在发酵过程中无法生存，而剩余的细菌具有一定的耐盐性，如A 组和B组的盐单胞菌，它可以在绝对盐度为0%～32%的条件下生长[24]。乳杆菌的相对含量最高，分别占C 组、A 组和B 组的10.41%、38.2%和53.17%。在高盐的情况下控制其他菌群的繁殖，可以促进乳酸菌的繁殖。乳酸菌在大自然中广泛分布，主要分布在植物和发酵产物的表面。乳酸菌是果蔬发酵的重要菌群，在水果发酵进程中通过乳酸发酵，使原料中的糖类分解成乳酸以及其他风味产物。A、B 和C 组样品中棒状杆菌相对含量较高，分别占12.01%、6.72%和1.64%，A 组相对含量最高，推测在含盐量约10%的条件下，有利于棒状杆菌下某些发酵细菌的生长。

2.2 腌制芥菜中优良菌株的筛选

3 组样品中又分别筛选出了9 株满足革兰氏菌染色鉴定呈阳性、过氧化氢酶试验结果呈阴性、不含芽孢体的菌株并分别编号为Z-1～Z-9。观察发现大部分的菌种多为棒型和短杆型，除此之外还有圆球形。通过测定菌株发酵液pH 值和不同含盐量下的发酵液菌株的生长密度来筛选优良菌种，结果见图4、图5。

图4 单菌株发酵48 h 的pH 值Fig.4 pH values of leaf mustard fermented with single strains for 48 h

图5 单菌株在不同含盐量发酵液中的菌体密度Fig.5 Cell density of single strains in fermentation broths with different salt content

由图4 可知，Z-1 和Z-3 的pH 值过低，酸味过重对腌制芥菜的味道产生不良的影响，但Z-2、Z-4、Z-6、Z-7、Z-9 的pH 值均在3.7 左右。由图5 可知，Z-1、Z-2、Z-5、Z-6、Z-9 在低盐浓度的芥菜发酵液中的分子间密度的OD 值较高，而Z-1、Z-5 随着盐浓度的提高菌体密度OD 值急剧下降，而Z-2、Z-6、Z-9 菌株在较高盐浓度的发酵液中存活密度仍高于其他菌株，表明这3 株菌能在芥菜发酵过程中良好地存活，具有较强的耐盐能力。综上所述，筛选出的3 株产酸能力强且耐盐度高的菌株为Z-2、Z-6、Z-9，接下来对筛选出的优势菌进行进一步的鉴定。

2.3 菌株的生理生化试验结果分析

3 株产酸能力强且耐盐度高的菌种同时进行生理与生化试验，结果见表2。

表2 菌株生理生化试验Table 2 Physiological and biochemical tests of strains

由表2 可知，3 株细菌均不产生硫化氢和吲哚类，接触酶测定为阴性，硝酸盐测定为阳性，但有一定的耐酸性。

2.4 菌株的16S rDNA 鉴定

筛选得到的3 株乳酸菌Z-2、Z-6、Z-9 的16S rDNA 序列长度分别为1448、1438、1450 bp，Z-2 株菌与的16S rDNA 与库中的戊型乳杆菌菌株相似度均在99%以上，Z-6 株菌的16S rDNA 与库中的植物乳杆菌菌株相似度均在99%以上，Z-9 株菌的16S rDNA 与库中的希腊魏氏菌菌株相似度均在99%以上。基于16S rDNA 基因序列，3 株菌株的系统发育树见图6。

图6 菌株系统发育树Fig.6 Phylogenetic tree of strains

由图6 可知，Z-2 的亲缘性与NR 029133.1 Lactobacillus pentosus strain 最接近，Z-6 的亲缘性与NR 115605.1 Lactobacillus plantarum strain 最接近，Z9 的亲缘性与NR 136437.1 Weissella bombi strain 最接近，经过采用传统菌种鉴定检测方法、生理及生化综合试验方法结合现代分子生物学筛选方法分析可以准确得出经过筛选纯化的3 株菌体分别是为戊糖乳杆菌、植物乳杆菌、希腊魏氏菌。

3 结论

利用高通量测序分析技术分别对不同发酵工艺和食盐用量的3 组发酵芥菜中产生的细菌在16S rDNA 的V4-V5 区进行测序与分析，发现不同腌制工艺和不同食盐用量的发酵芥菜中细菌结构组成具有一定的差异性。通过OTUs 聚类分析，A、B 两组腌制芥菜样品的OUTs 数量明显高于C 组，且A、B 两组的细菌丰富度也高于C 组，但C 组的多样性高于A、B 两组。结果表明3 组发酵芥菜在细菌门类组成上属于主要的优势菌门为厚壁菌门、变形菌门、放线菌门、拟杆菌门；优势菌群属又划分为乳杆菌属、棒杆菌属、短杆菌属、不动杆菌属、盐单胞菌属，其中，A、B 两组样品的细菌菌落组成相似，与C 组样品的细菌菌落组成相差较大。这可能是因为高盐抑制了大部分菌的生长，导致许多不耐盐的菌在发酵过程中无法存活，而在含盐量较低的C 组中存在的细菌种数更多，在含盐量到达10%以上盐渍芥菜所存在的菌群基本都是耐盐的细菌，其细菌多样性和丰富度基本相似，而较高的含盐量使芥菜的细胞壁受损，流出更多的营养物质，因而A、B 组的细菌丰富度偏高，同时加工工艺的不同也会造成腌制芥菜菌群结构的差异。

为寻找适合腌制芥菜直投式发酵的乳酸菌，根据产酸能力和耐盐性筛选出3 株乳酸菌。通过菌落形态观察、生理生化试验和16S rDNA 鉴定出3 株优势菌株分别为戊糖乳杆菌（Lactiplantibacillus pentosus strain）、植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum strain）和希腊魏氏菌（Weissella hellenica strain），为乳酸菌在发酵芥菜的工艺生产提供新的理论依据。