伏牛山区六妹羊肚菌挥发性呈香物质分析

刘娜娜，程晓，潘珍珍，杨晓冰，3，李秀红*

（1.三门峡职业技术学院，河南 三门峡 472000；2.西北农林科技大学林学院，陕西 杨凌 712100；3.河南科技大学应用工程学院，河南 三门峡 472000）

羊肚菌（Morchella esculenta）是一种真菌，又称羊肚菜、羊蘑等，因其形状类似羊肚而得名，是名贵食材“草八珍”之一，富有“素中之荤”的美称，羊肚菌生长分布遍布世界各地，因产量较少而愈显珍贵。羊肚菌的食用历史悠久，具有化痰理气、补脑提神、润胃健脾、补肾强身等功效。现代研究表明，羊肚菌含有多种氨基酸、脂肪酸、多糖和核苷酸等营养物质为人体所需，具有增强免疫力、抗肿瘤、抗疲劳以及抗氧化等功效[1-2]，研究发现羊肚菌中生物活性物质具有抗炎、降血糖、预防动脉粥样硬化等生理功效[3]。羊肚菌除了具有较高的营养价值，同时还拥有独特的风味，经过熬制后的羊肚菌汤色泽良好，味道鲜美[4]。通过炒酱和熬制等加工工艺，可将羊肚菌与其它食材进行合理配比制成风味食品，如羊肚菌牛肉酱，羊肚菌猪骨汤等，有利于更大程度发挥羊肚菌的子实体风味价值。

通常食用菌风味由香味和滋味组成，分别作用于嗅觉和味觉器官，食用菌的香味来源于酸类、醛类、酮类、酯类等挥发性物质，因这些物质易于挥发到空气中，进而引起嗅觉反应，另一些非挥发性滋味物质，主要成分包括呈味氨基酸、可溶性糖、糖醇、5'-核苷酸、有机酸等，可引起舌头的味觉反应[5-6]。有文献报道我国川藏地区与长白山地区所产羊肚菌的挥发性和非挥发性呈味物质的组成，发现不同地区羊肚菌的呈味物质有所不同，研究表明气相-离子迁移谱检测技术对羊肚菌的风味化合物分析可区分羊肚菌的不同产地[7-9]。为了分析我国中原地区羊肚菌的风味组成，本试验选取产自秦岭北麓河南三门峡伏牛山地区的六妹羊肚菌品种为试验材料，通过多种顶空吸附萃取条件对羊肚菌的挥发性成分进行收集，再进行气相色谱-质谱联用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）分析，以明确本地区羊肚菌的挥发性呈香物质组分，为该地区六妹羊肚菌的功能性食品药品开发与产业的精深加工提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

六妹羊肚菌：三门峡九龙山农业科技有限公司。将羊肚菌干品粉碎处理，过40、100、200 目筛，-20 ℃保存。

3-壬酮：武汉浩荣生物科技有限公司；氯化钠、浓硫酸：西陇科学股份有限公司；葡萄糖、无水乙醇、无水乙醚：天津永大化学试剂有限公司；浓盐酸、苯酚：成都科隆化学试剂有限公司。所用试剂均为分析纯。

SZ-TR320 型消解炉：德国默克公司；KL-SWCK6型马弗炉：鹤壁科力测控技术有限公司；KjeltecTM 8400 型全自动凯氏定氮仪：丹麦福斯集团公司；ISQ&TRACEISQ 型气质联用仪：美国赛默飞世尔科技有限公司；DP-D501 型冷冻干燥机：深圳德普仪器有限公司；AUY200 型分析天平：上海精密仪器仪表有限公司；GFL-230 型烘箱：天津莱玻特瑞仪器设备有限公司；HC-3018 型高速离心机：安徽中科中佳科学仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 羊肚菌基本成分鉴定

水分含量测定：参考GB 5009.3—2016《食品安全国家标准食品中水分的测定》中直接干燥法。

粗脂肪含量测定：参考GB5009.6—2016《食品安全国家标准食品中脂肪的测定》中酸水解法。

灰分含量测定：参考GB 5009.4—2016《食品安全国家标准食品中灰分的测定》中灰分测定法。

蛋白质测定：取样品0.2 g 于消化管中，再加入3 g催化剂（硫酸铜∶硫酸钾=1∶9，质量比）和5 mL 硫酸后，于消解炉进行消化。当温度达到420 ℃后，继续消化3 h，使其自然冷却至室温，将消化管取出，随后在全自动凯氏定氮仪上测定。

粗多糖测定：采用苯酚-浓硫酸法，首先绘制标准曲线。将10 mg 葡萄糖溶解并定容于100 mL 容量瓶（葡萄糖浓度0.1 g/L），取试管6 支，分别装入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 葡萄糖溶液，补充蒸馏水至2.0 mL，然后各试管再分别加入1 mL 5%苯酚、5 mL 浓硫酸，将试管置于沸水浴中处理15 min 后，取出试管，水浴降温至室温，在490 nm 下测定样品吸光值。采用Origin 回归分析，得到线性回归方程，并绘制方程曲线，横坐标为多糖浓度X（μg/mL），纵坐标为吸光值Y，即得到葡萄糖标准曲线。建立标准曲线方程为Y=0.005 2X-0.004 1，R2=0.998 7。

称取1 g 羊肚菌粉，按料液比1∶51（g/mL）混合，水浴恒温46 ℃提取，提取时间3.5 h，4 000 r/min 离心10 min，得到上清提取液，将提取液于100 mL 容量瓶定容得样品液。样品液取0.1 mL 放入试管，处理方法与标准液相同，获得处理液在490 nm 处的吸光值后，通过标准曲线方程计算出多糖浓度，带入公式（1），经计算即可获得羊肚菌中粗多糖的含量。

式中：W 为多糖含量，%；C 为多糖浓度，μg/mL；V为定容体积，mL；N 为稀释倍数；M 为样品质量，g。

1.2.2 挥发性呈味物质测定

参考殷朝敏等[10]的方法稍作修改，试验通过选取多种萃取条件，以达到充分获取挥发性物质的目标。羊肚菌子实体经破碎为不同粒度（40、100、200目），分别称取不同粒度羊肚菌干粉样品1.5 g 置于40 mL 采样瓶中，加蒸馏水10 mL、NaCl 1.5 g，再加入32.64 μg/mL 3-壬酮10 μL 作为内标。样品混匀，使用聚四氟乙烯隔热垫密封瓶口，在试验设置的温度下（50、60、70 ℃）分别采用磁力搅拌平衡10 min，再用预先老化好的萃取头顶空吸附，吸附完成后，将萃取头置于气相色谱-质谱联用仪进样口解吸，解吸温度250 ℃，时间2.5 min，然后进行GC-MS 分析。

GC 条件：色谱柱为Innowax 极性毛细管柱（60 m×0.25 mm×0.25 μm）；程序中初始温度40 ℃，保持2 min；升温速度3 ℃/min，升至180 ℃时保持2 min，然后升温速度为10 ℃/min，升至260 ℃保持1 min；载气为高纯度氦气，气体流速为1.0 mL/min；进样口温度250 ℃，不分流。

MS 条件：使用电子电离源；电子能量为70 eV，电压350 V，质量扫描范围50～450 m/z；离子源温度230 ℃；传输线温度280 ℃；四极杆温度150 ℃。

1.2.3 关键风味化合物评定

采用相对气味活度值（relative odor activity value,ROAV）评定羊肚菌样品中的关键风味化合物，参考刘登勇等[11]的方法，首先计算各挥发性组分的气味活度值（odor activity value，OAV），确定对香气贡献最大的组分，其公式如下。

式中：O 为各挥发组分的气味活度值，%；C 为风味物质的含量，μg/kg；T 为该物质的嗅觉阈值，μg/kg。

根据OAV 结果，值最大的定义对香气贡献最大，该物质组分相对气味活度值为100，其它风味物质按下列公式计算相对气味活度值。

式中：Ri代表各组分ROAV；Oi和Omax分别为各化合物组分的OAV；Ci为各组分的含量，μg/kg；Ti为各组分的感觉阈值，μg/kg。

样品中某种风味物质ROAV 越大，那么在总体风味该物质的贡献也越大。一般认为样品的关键风味物质为1≤ROAV≤100 的组分。此外，对总体风味具有重要修饰作用的物质为0.1≤ROAV＜1.0 的组分。

1.3 数据统计与分析

仪器检索系统利用标准谱库对GC-MS 总离子流图的各峰进行比对分析，以对比度90%为基准，结合标准质谱图和保留时间来确认各挥发性化合物的种类和总量。数据统计和分析使用Microsoft Excel 2007进行，柱形图的绘制使用GraphPad Prism 9 软件。

2 结果与分析

2.1 羊肚菌常规组分分析

羊肚菌常规组分含量如表1 所示。

表1 羊肚菌（干品）常规组分含量Table 1 Basic nutrients in Morchella sextelata（dried）

从表1 可以看出，羊肚菌的蛋白质含量较高，为36.33%，粗多糖和粗脂肪含量较低，粗脂肪含量仅有1.34%。

2.2 萃取结果分析

不同萃取条件下有效峰面积占比见表2。

表2 不同萃取条件下有效峰面积占比Table 2 Ratio of effective peak area under different extraction conditions

由表2 可知，鉴定出挥发性物质最多的条件为100 目60 ℃40 min 和100 目50 ℃60 min，均鉴定出43 种物质。相同温度、相同萃取时间下，样品破碎至40目萃取富集挥发物的效果较差，鉴定出的物质种类和含量较少，样品粉碎目数越高，萃取获得的挥发物含量越高。在100 目粉碎条件下，萃取温度60 ℃，萃取40 min 或60 min 的有效峰面积差异不大，在40 min 时已基本完成对有效物质的采样、富集，但随着时间的延长，总峰面积稍有增加，但同时也使杂质被萃取的可能性增加。在100 目粉碎条件下，萃取相同时间，随着萃取温度的变化有效峰面积也随之变化，50 ℃和60 ℃的有效峰面积差异较小。由于高温能够促使一些化合物降解，进而产生小分子挥发物，试验中以70 ℃条件下的有效峰面积最大，推测70 ℃条件下有部分高分子物质分解，但高温条件下的数据有助于分析烹饪条件下的挥发性物质组成。

2.3 挥发性物质组分分析

不同萃取条件下羊肚菌干品挥发性成分的组成和含量见表3。各类组分总量统计图见图1。

图1 挥发性物质组分与含量统计图Fig.1 Content of volatile components

表3 不同萃取条件下羊肚菌干品挥发性成分组成及含量Table 3 Content of volatile components of dried Morchella sextelata extracted under different conditions

由表3 可知，试验总共鉴定出的62 种化合物，包括18 种醛类、12 种醇类、2 种酸类、4 种酯类、8 种酮类、1 种烯烃类、11 种烷烃类、2 种炔类、3 种芳香烃类、1 种呋喃类，并经过色谱软件的计算获得了相应化合物的精确含量。经统计分析，图1 显示出挥发性化合物中含量较多的化合物主要是醛类化合物与烷烃类化合物。由表3 可知，在100 目60 ℃40 min 的萃取条件下，烷烃类与醛类化合物总含量均达到5 000 μg/kg，挥发性化合物中1，3-二溴丙烷含量最多，含量为6 954.59 μg/kg。在几种萃取方案中，烷烃类、醛类均为挥发性化合物的主要组分，且以1，3-二溴丙烷含量最多。综合色谱分析结果发现化合物1，3-二溴丙烷在羊肚菌干品分离的保留时间为31.00 min 左右，含量在4207.86～8304.31 μg/kg 之间。1，3-二溴丙烷是重要的挥发性成分之一，由于该物质无嗅而口感略带甜味，因此对嗅觉风味没有明显影响。此外在本试验条件下，鉴定出了几种含量较高且对羊肚菌风味有潜在影响的化合物，如正己醛、正壬醛、癸醛、苯乙醛、1-辛烯-3-醇、正己醇、正己酸、2-壬酮、香叶基丙酮、1-溴-3-氯丙烷等，这些化合物对风味的贡献本试验采用相对气味活度值进行了评价。

2.4 关键风味化合物评定

根据试验方法中的计算公式，本试验统计和分析了羊肚菌中所有挥发性化合物的相对气味活度值，具有风味影响的挥发性化合物见表4。

表4 羊肚菌中ROAV＞0.1 的挥发性物质及其气味特征Table 4 Odor characteristics of M.sextelata volatile substances with ROAV＞0.1

由表4 可知，羊肚菌（干制品）中的关键风味化合物有14 种，分别为2-甲基丁醛、异戊醛、正己醛、正壬醛、E-2-辛烯醛、癸醛、苯乙醛、椰子醛、反-2-壬烯醛、正己醇、1-辛烯-3-醇、正己酸、2-壬酮、香叶基丙酮。其中ROAV 最大的化合物为癸醛，其次为反-2-壬烯醛、香叶基丙酮、正己醇。癸醛的风味在稀释时有甜橙和橘子香气，并带有油脂气息，其成分天然存在于柑橘、柠檬、园柚、西红柿、草莓中[12]，本试验不同萃取条件下的样品中癸醛的含量均较高（612.78～1 134.45 μg/kg）。反-2-壬烯醛带有一些黄瓜味和柑橘味，因其气味阈值很低而在本试验中呈现较高的ROAV。香叶基丙酮具有新鲜、清、淡的花香香气，而正己醇具有特殊香味。此外，对总体风味具有重要修饰作用的风味物质主要有2-庚烯醛、甲基壬基甲酮、2-戊基呋喃。

3 讨论与结论

关于羊肚菌中的常规组分含量，试验对六妹羊肚菌基本组分的分析发现，其蛋白质含量达36.33%，是名副其实的高蛋白食品。一些食用菌的研究表明，真菌类食品中普遍含有较高的蛋白质，文献报道的几种食用真菌蛋白质含量，如香菇（21.90%）、金针菇（18.30%）、茶树菇（26.07%）、黑木耳（11.20%）[13]、顺昌菌草竹荪（24.01%）、竹屑竹荪（19.47%）[14]、鸡杉（24.2%）、松灵芝（26.6%）、冬虫夏草（29.1%）等[15]，相比之下，本试验羊肚菌的蛋白质含量属于真菌食品中较高的一类。另外本试验中所测定羊肚菌的粗脂肪、粗多糖含量仅有1.34%、6.93%，属于低脂低糖食品。

食用菌中的嗅觉致香物质即风味因子来自于主体挥发性香气成分，是食用菌的决定性风味因子。不同生态环境造成的生物代谢差异可导致食用菌的风味因子不同，例如同一品种羊肚菌，来自川西高原的含有二十烷，来自成都平原的含有1-辛烯-3-醇，而丘陵地区样品含二硫化合物等[16]。长白山、林芝羊肚菌风味化合物特征峰与青川、香格里拉产地的羊肚菌差异较大[7]。本试验的羊肚菌样品来自华北平原西部的秦岭北麓（三门峡市伏牛山区），样品中也检测出与成都平原羊肚菌样品相同的1-辛烯-3-醇是关键风味化合物成分之一。

羊肚菌的挥发性物质会在不同的烹制条件下逐步挥发出来，付瑞青等[17]对羊肚菌在煮制过程中共收集到49 种挥发性风味物质，一些风味物质在煮制的不同时间出现。考虑到在不同的温度条件下，食用蕈挥发出的香气成分会受到影响并发生变化[18]，因此本试验尝试通过改变的条件参数，尽可能完全地把同一种羊肚菌中所存在的挥发性呈味物质全部检测出来，结果显示本试验共鉴定出62 种挥发性物质，单一条件下获得羊肚菌挥发性物质最多达到43 种。

李翔等[8]在野生和人工栽培羊肚菌菌盖干品中，共检测出42 种挥发性成分，其中野生品种中以正己醛（17.99%）含量最高，人工栽培羊肚菌中以甲酸己酯（7.86%）含量最高。谢丽源等[19]对栽培品种川羊肚菌的分析发现其挥发性物质主要包括7 类，以醛类化合物比例最高，其次是酯、醇、烃化合物、含硫化合物等，并有少量酮、呋喃。本试验获得的GC-MS 图谱中，鉴定出的风味化合物以醛类总含量最高，其次还有醇类、酸类、酯类、酮类和烃类。挥发性化合物对风味组成的贡献是由该挥发性物质的含量和气味阈值共同决定，所以相对含量高的挥发性化合物不一定是对香气贡献大的化合物。如本试验中挥发性物质以1，3-二溴丙烷的含量最高，但此物质在羊肚菌风味中的贡献在于味觉。研究表明食用菌鲜味主要来源于氨基酸类鲜味物质和呈味核苷酸，例如蘑菇的鲜味一部分来自5'-核苷酸，当蘑菇与其他食材一起烹饪，5'-核苷酸不仅提供鲜味来源，还对其他食材的甜味、肉味有增效作用，同时抑制食材中的不愉快味道如咸、酸、苦味等[20]。因此对于羊肚菌的风味分析，除了挥发性香味物质，其入口滋味的组成也值得进一步研究。

本试验以羊肚菌为研究对象，通过测定羊肚菌基本物质组分含量，结果显示羊肚菌具有富含蛋白质、低脂肪、低糖的特点。通过不同前处理结合顶空固相微萃取，对羊肚菌的挥发物成分进行收集，再使用气相色谱-质谱联用（GC-MS）技术对收集到的羊肚菌挥发性物质进行分析，共鉴定出62 种挥发性物质，主要包括18 种醛类、12 种醇类、2 种酸类、4 种酯类、8 种酮类、1 种烯烃类、11 种烷烃类、2 种炔类、3 种芳香烃类和1 种呋喃类。经ROAV 评价方法分析，认为试验羊肚菌的关键风味化合物有14 种，贡献最大的是癸醛，有甜橙和橘子香气，其次是反-2-壬烯醛、香叶基丙酮、正己醇，具有修饰作用的化合物有3 种。

羊肚菌的开发与利用离不开对羊肚菌的基础研究，探究羊肚菌香气和滋味的关键组成，有助于发掘羊肚菌风味的形成机理，进而对羊肚菌关键组分的提取与利用提供基础，促进羊肚菌的产品深加工，形成羊肚菌特有的风味产品。本试验解析了羊肚菌风味特征中的呈香化合物，有助于理解羊肚菌的风味特点，对羊肚菌的深加工、羊肚菌的定向种植有一定的理论指导意义。