白鲢鱼酸/碱等电点沉淀法分离蛋白及其凝胶特性

成希祥，吴杰

（1.内蒙古财经大学旅游学院，内蒙古 呼和浩特 010070；2.浙江工商大学海洋食品研究院，浙江 杭州 310012）

白鲢鱼肉质细嫩、味道鲜美、营养价值高，富含多种人体所需的脂肪酸和氨基酸等营养成分，是我国重要的淡水养殖经济型鱼类[1-2]。据2020 年《中国渔业年鉴》统计，我国白鲢鱼产量高达381.0 万t，且产业链逐渐完善，产业经济价值逐渐扩大，因此白鲢鱼具有巨大的开发潜力和重要的渔业生态地位[3]。目前，白鲢鱼主要是加工成鱼糜或整条冷冻粗加工，其加工深度浅，产品种类单一，保质期短，无法满足远距离流通销售的需求，同时简单整条冷冻产品易导致鱼类出现试剂残留、品质劣变、营养成分和风味物质流失等问题[2，4]。目前，缺乏高品质精深加工技术，未能高效利用白鲢鱼鱼肉蛋白质，严重降低了白鲢鱼的经济价值，因此提高白鲢鱼的加工利用率及产品附加值、丰富白鲢鱼加工品种具有一定的研究意义。此外，鱼的分离蛋白作为高档的营养食品[5]，是实现白鲢鱼的高值化利用的有效方式。

目前，国内外关于利用鱼肉制备分离蛋白的方法主要有漂洗法、有机溶剂萃取法、酶解法和酸/碱等电点沉淀法，不同的制备方法会使分离蛋白的营养价值和凝胶特性等受到不同程度的影响[6-9]。目前的研究表明，漂洗法通过浓缩盐溶性肌原纤维蛋白去除血渍等杂质，延长鱼糜制品的货架期，但易造成可溶性蛋白质流失，同时产生大量的工业有机废水[6]。低值鱼或鱼类加工下脚料经过高温蒸煮、压榨和有机溶剂萃取法可制备成鱼粉或鱼浓缩蛋白质，但其萃取过程中的高温压榨易使蛋白质变性，且有机溶剂易出现残留等问题[7]。酶解法可生产多种小分子组成的水解蛋白质，但酶解体系相对复杂且对温度敏感，同时易造成分离蛋白的功能性和风味差，难以满足食品加工的要求[8]。而酸/碱等电点沉淀法是利用蛋白质在不同pH 值的溶解特性差异达到蛋白质分离效果，同时会使蛋白质分子的构象发生变化，进而影响蛋白质的凝胶性、营养价值等[9-10]。与其他分离蛋白的方法相比，酸/碱等电点沉淀法具有回收蛋白质效率高，操作简单等特点，能有效去除鱼肌肉中的脂肪成分，且能高效提取分离蛋白，保持其生物活性[9-10]。因此，本研究以新鲜白鲢鱼为原料，采用酸/碱等电点沉淀法制备分离蛋白，优化蛋白质分离的条件，比较5 种工艺条件（pH3.0-5.5、pH4.0-5.5、pH11.0-5.5、pH12.0-5.5 和pH13.0-5.5）下制备白鲢鱼分离蛋白的差异，旨在为酸/碱等电点沉淀法在白鲢鱼分离蛋白中的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鲜活白鲢鱼：市售；Lowry 试剂盒：北京鼎国昌盛生物技术有限公司；氢氧化钠、硫酸、盐酸（均为分析纯）：广东光华科技股份有限公司。

1.2 仪器与设备

Thermo Scientific Sorvall LYNX 高速冷冻离心机：上海寰熙医疗器械公司；NAI-XHL-4A 消化炉：上海那艾精密仪器有限公司；VAP-450 自动凯氏定氮仪：德国Gerhardf 公司；TA.XT plusC 质构仪：英国STab.Micro System 公司；EVO 300PC 紫外分光光度计：美国Thermo Fisher Scientific 公司；LGJ-12 真空冷冻干燥机：北京松源华兴科技发展有限公司。

1.3 方法

1.3.1 白鲢鱼分离蛋白的提取及其蛋白粉的制备

采用酸/碱等电点沉淀法制备白鲢鱼分离蛋白[11]。

取白鲢鱼肉，按照肉水比为1∶9（g/mL）添加去离子水并均质搅拌4 min，随后将pH 值分别调节至3.0、4.0、11.0、12.0 和13.0，并搅拌40 min，10 000 r/min 离心30 min（4 ℃），得到的上清液即为可溶性鱼肉蛋白质，再调节上清液pH 值至等电点5.5，10 000 r/min 离心30 min（4 ℃），取沉淀，加少量去离子水分散、调节pH8.0、蒸馏水透析、真空冷冻干燥，即可得到pH3.0、4.0、11.0、12.0 和13.0 5 种条件下制备的分离蛋白，-20 ℃保存备用。

1.3.2 白鲢鱼肉及其分离蛋白主要成分的测定

水分测定参考GB 5009.3—2016《食品安全国家标准食品中水分的测定》中的直接干燥法；粗蛋白测定参考GB 5009.5—2016《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》中的凯氏定氮法；粗脂肪测定参考GB 5009.6—2016《食品安全国家标准食品中脂肪的测定》中的索氏抽提法；灰分的测定参考GB 5009.4—2016《食品安全国家标准食品中灰分的测定》。

1.3.3 白鲢鱼分离蛋白得率的测定

参考石柳[12]的方法测定分离蛋白得率。利用凯氏定氮法测定5 种分离蛋白的粗蛋白质含量和原料鱼肉中粗蛋白质含量，并根据公式（1）计算分离蛋白得率（P）。

式中：P 为分离蛋白得率，%；M 为分离蛋白的粗蛋白质含量，g；W 为原料鱼肉中粗蛋白质含量，g。

1.3.4 白鲢鱼分离蛋白溶解度的测定

利用Lowry 试剂盒法测定分离蛋白的溶解度[13]。配制浓度0.5%的分离蛋白溶液，在4 ℃下磁力搅拌30 min，随后5 000 r/min 离心15 min（4 ℃），利用Lowry试剂测定上清液中蛋白质含量，对比分析5 种分离蛋白在pH 值浓度梯度（2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0）条件下的溶解度，分离蛋白溶解度的计算见公式（2）。

式中：Q 为分离蛋白溶解度，%；R 为上清液中蛋白质含量，g；S 为离心前溶液中蛋白质含量，g。

1.3.5 白鲢鱼分离蛋白氨基酸组成的分析

白鲢鱼分离蛋白氨基酸组成的分析参考孙乐常等[10]的方法。检测条件：采用Eclipse-AAA 色谱柱（4.6 mm×150 mm，直径5 μm），检测波长为338 nm 和262 nm，进样量为0.5 μL，流速为2 mL/min。

1.3.6 白鲢鱼分离蛋白凝胶的制备及其质构的测定

取适量分离蛋白，配制成浓度为12%的蛋白质溶液，调节pH7.0，采用二段式加热制备分离蛋白凝胶，测定凝胶的凝胶强度和全质构分析（texture profile analysis，TPA）[14]，其中探头型号分别是P/0.5S 和P/0.5，同时采用Texture Expert（v 1.22）程序采集并计算凝胶的硬度、弹性、胶着性和咀嚼性。

1.3.7 白鲢鱼分离蛋白凝胶持水性的测定

利用离心法测定分离蛋白凝胶的持水性[15]。称取质量为M1的分离蛋白凝胶，用两层滤纸包裹装入离心管，5 000 r/min 离心15 min，取出样品并称量，测得离心后样品的质量为M2，凝胶持水性（W，%）计算如公式（3）。

1.3.8 白鲢鱼分离蛋白凝胶扫描电镜观察

参考Zhou 等[15]的方法并略微修改。将蛋白质凝胶样品切成薄片（厚度约为5 mm），用2.5%戊二醛溶液固定、pH6.8 磷酸盐缓冲液洗涤，随后样品经梯度浓度的乙醇脱水，再利用乙酸异戊酯置换乙醇15 min、临界点干燥和喷金，最后利用扫描电子显微镜观察蛋白质凝胶的微观结构，放大倍数为15 000。

1.4 数据统计与分析

所有试验重复3 次，采用SPSS 18.0 软件分析数据，并利用Duncan 多重检验分析差异显著性（P＜0.05表示差异显著），同时利用Origin 9.0 软件绘制图形，且结果以平均值±标准差的形式表示。

2 结果与分析

2.1 白鲢鱼鱼肉及其分离蛋白基本成分含量的测定分析

白鲢鱼鱼肉及其分离蛋白基本成分含量的测定分析见表1。

表1 白鲢鱼鱼肉及其分离蛋白基本成分的含量Table 1 Content of basic nutrient components in silver carp meat and its protein isolate powder g/100 g

如表1 所示，白鲢鱼鱼肉的基本成分包括水分、粗蛋白、粗脂肪和灰分，总量占比高达99.77 g/100 g，其含量水平与其他研究报道有一定差异[16]，可能受白鲢鱼生长环境、年限、捕捞季节与方式等诸多因素影响。此外，白鲢鱼肉粗蛋白含量高，高达17.52 g/100 g，表明白鲢鱼属于高蛋白质鱼种，是加工分离蛋白的优良原料。

利用酸/碱等电点沉淀法制备的白鲢鱼分离蛋白中，其粗蛋白的含量均高于78 g/100 g，水分含量均低于12 g/100 g。在碱法制备的分离蛋白中，其粗蛋白含量高，水分含量低。pH12.0-5.5 组粗蛋白含量最高，达81.96 g/100 g，且水分含量仅为9.76 g/100 g，这可能与强碱比强酸更能有效去除油脂和不溶性杂质有关。极端酸碱性条件能够改变蛋白质表面的电荷量，提高蛋白质的溶解度，因此在低温高速离心下能有效去除油脂和不溶性杂质，提高分离蛋白中蛋白质的含量，降低粗脂肪的含量。且碱法制备（pH12.0-5.5）的分离蛋白中，其粗脂肪含量低，仅为3.52 g/100 g。在5 种分离蛋白中，灰分含量均不超过2.23 g/100 g，表明酸/碱等电点沉淀法能有效去除鱼肉中所含的盐类及其他不溶性杂质。且碱法制备的分离蛋白的灰分含量比酸法制备的灰分含量低。因此碱法（pH12.0-5.5）制备分离蛋白的效果最佳，这与刘诗长[7]的研究结果一致。

2.2 白鲢鱼分离蛋白得率的测定分析

酸/碱等电点沉淀法提取白鲢鱼分离蛋白的得率见图1。

图1 酸/碱等电点沉淀法提取白鲢鱼分离蛋白的得率Fig.1 Yield of protein isolate prepared from silver carp meat by acid/alkali solubilization-isoelectric precipitation

酸/碱等电点沉淀法提取鱼分离蛋白是通过调控蛋白质表面的静电荷量，使其在等电点处所带的净电荷为零，失去了水化膜和分子间的相斥作用，疏水性氨基酸残基暴露，蛋白质分子相互靠拢、聚集，易形成沉淀析出[17]。由图1 可知，在偏离鱼蛋白质等电点的pH值条件下，提取白鲢鱼分离蛋白的得率均超过54%，表明鱼蛋白质在极端酸碱性条件下有较强的溶解性。在相同的沉淀条件下，酸法提取白鲢鱼分离蛋白比碱法提取的得率低，且碱法提取（pH12.0-5.5 和pH13.0-5.5）白鲢鱼分离蛋白的得率较高，这可能与蛋白质分子大小和表面电荷有关，导致鱼蛋白质在碱性条件下更容易电离水解[7]。因此碱法提取白鲢鱼分离蛋白的得率最高。

2.3 白鲢鱼分离蛋白溶解度的测定分析

不同pH 值下白鲢鱼分离蛋白的溶解度见图2。

图2 不同pH 值下白鲢鱼分离蛋白的溶解度Fig.2 Solubility of silver carp protein isolate samples prepared at different pH values

由图2 可知，pH 值对白鲢鱼分离蛋白溶解性的影响较明显，且各分离蛋白的溶解度随pH 值的变化趋势基本相同。当pH 值（5.0～6.0）接近等电点处，分离蛋白的溶解度最低，而偏离等电点处，溶解度随pH 值变化迅速上升，且在极端酸碱性处，分离蛋白的溶解度均接近于100%。此外，不同pH 值条件下制备的分离蛋白，其溶解性各不相同。与酸法提取相比，碱法提取制备的分离蛋白溶解性最好，而pH4.0-5.5 条件下制备的分离蛋白溶解性最差。在极端酸碱性条件下，蛋白质中呈酸性或碱性氨基酸残基的电荷被中和，促使蛋白质分子带正电荷或负电荷，与水分子的作用增强，明显提高蛋白质的溶解性。然而，在接近等电点5.0～6.0处，蛋白质与水分子的作用比较弱，使得蛋白质分子相互靠拢，甚至形成聚集体而导致蛋白质沉淀[17]。因此，在极端酸碱性条件下，蛋白质的溶解性最好，在等电点处溶解性最差。

2.4 白鲢鱼分离蛋白氨基酸组成分析

白鲢鱼分离蛋白的氨基酸组成及含量见表2。

表2 白鲢鱼分离蛋白的氨基酸组成及含量Table 2 Amino acid composition and content of silver carp protein isolate samples g/100 g

蛋白质中氨基酸的种类和含量是衡量鱼蛋白粉品质的重要指标。由表2 可知，5 种不同分离蛋白及原料中均含有16 种常见氨基酸，其中包含8 种必需氨基酸(组氨酸为婴儿必需氨基酸)，并且分离蛋白中氨基酸的含量大部分高于鱼肉中氨基酸含量，表明酸/碱等电点沉淀法制备的分离蛋白的氨基酸种类齐全，参考联合国粮农组织/世界卫生组织（Food and Agriculture Organization/World Health Organization,FAO/WHO）规定的蛋白质理想模式，优质蛋白质中必需氨基酸与总氨基酸的比值约在40%，而必需氨基酸与非必需氨基酸的比值大于60%[18]。据表2 所示，5 种分离蛋白中必需氨基酸与总氨基酸的比值均大于40%，且必需氨基酸与非必需氨基酸的比值均在73%以上，符合FAO/WHO 规定的蛋白质理想模式，因此酸/碱等电点沉淀法制备的5 种分离蛋白均属于优质蛋白粉。在极端酸性条件下，蛋白质中碱性氨基酸（赖氨酸和组氨酸）的负电荷被中和而被破坏，降低蛋白质中的必需氨基酸的含量，因此在酸法制备的分离蛋白中，其必需氨基酸的含量相对较低，尤其是赖氨酸和组氨酸。在极端碱性条件下，蛋白质中酸性氨基酸（谷氨酸和天冬氨酸）的正电荷被中和而被破坏，降低蛋白质中的呈味氨基酸的含量。此外，在极端酸碱性条件下，蛋白质变性的程度越大，分离蛋白的提取得率和纯度越高。综上所述，酸/碱等电点沉淀法提取制备的分离蛋白的氨基酸标准模式评分均满足理想蛋白质的要求，进一步表明分离蛋白是一种优质的蛋白质源，且碱法提取制备分离蛋白的提取得率和纯度最高，其中碱法提取（pH12.0-5.5）制备的分离蛋白品质最佳。

2.5 白鲢鱼分离蛋白的凝胶特性和持水性分析

白鲢鱼肉分离蛋白的凝胶特性和持水性见表3。

表3 白鲢鱼肉分离蛋白的凝胶特性和持水性Table 3 Gel properties and water-holding capacity of silver carp protein isolate

凝胶强度和破断强度均能反映蛋白质受热变性形成凝胶的能力，主要取决于蛋白质分子间相互作用力的强弱和分离蛋白质三维网状结构的变化[19]。由表3可知，与酸法提取相比，碱法提取制备的鱼分离蛋白其凝胶体系具有强的凝胶强度和破断强度，并且碱法提取（pH12.0-5.5）所制得的分离蛋白，其凝胶的凝胶强度和破断强度最强。此外，碱法提取所制得的分离蛋白，其凝胶具有强的硬度、胶着性和咀嚼性，而凝胶的弹性弱于酸法提取所制得分离蛋白凝胶，表明碱性条件下所制得的分离蛋白的凝胶具有强的质构特性，这与Park 等[20]的研究结果一致，沙丁鱼肌球蛋白在极端酸性条件下溶解，将pH 值调回中性会发生完全的蛋白质变性，严重降低了蛋白质形成凝胶的能力。此外，在分离蛋白形成凝胶过程中主要是肌球蛋白起作用，因此肌球蛋白的浓度和变性程度直接决定了分离蛋白形成凝胶的能力。在极端酸碱性条件下，鱼蛋白质的高级结构被严重破坏发生不可逆的变性，导致肌球蛋白丧失部分凝胶能力，尤其极端酸性条件破坏蛋白质凝胶之间的二硫键、氢键、疏水相互作用等交联的作用力，甚至导致其他内源性蛋白酶变性失活，降低分离蛋白的凝胶能力[10，21]。此外，肌球蛋白在极端酸性条件下完全的被解离，而在碱性条件下能够保持相对完整的结构特性[21]。因此，与酸法提取相比，碱法提取制备的分离蛋白，其形成的凝胶具有强的凝胶特性，并且pH12.0-5.5 条件下所制得的分离蛋白凝胶的凝胶特性最强。

2.6 白鲢鱼肉分离蛋白凝胶微观结构的观察

鱼分离蛋白凝胶的凝胶特性与其微观结构和组成密切相关，且其微观结构的形成取决于鱼分离蛋白的有序聚集，并直接影响凝胶的凝胶强度和破断强度[19]。白鲢鱼肉分离蛋白凝胶的扫描电镜图见图3。

图3 白鲢鱼肉分离蛋白凝胶的扫描电镜图（×15 000）Fig.3 Scanning electron microscope images (×15 000) of silver carp protein isolate gel

如图3 所示，在酸性条件下提取制备的分离蛋白，其凝胶的三维网络中孔洞大且多，表面凹凸粗糙，因此形成的凝胶的凝胶特性弱，且持水性低。而碱法提取制备的分离蛋白，其凝胶三维网络中孔洞变小，表面相对平缓，凝胶的凝胶特性明显增强，持水性明显提高，同时碱法（pH12.0-5.5）提取制得的分离蛋白，其凝胶的三维网络结构最致密均匀，且具有最强的凝胶强度和破断强度。由此进一步证明碱性条件下制备的分离蛋白，有利于形成致密均匀的凝胶三维网络结构，使凝胶具有强的凝胶特性和高的持水性能，这与分离蛋白凝胶的质构特性和持水性检测结果一致。极端酸碱性条件破坏鱼蛋白质的高级结构，尤其肌球蛋白被解离而丧失部分的凝胶能力，弱化了分离蛋白凝胶三维网络的致密性，降低了凝胶的质构特性和持水性[10，21]。然而，肌球蛋白在极端碱性条件下保持相对完整的结构特性[21]，因此与酸法提取相比，碱法提取制备的分离蛋白，其凝胶三维网络结构的孔目变少孔径变小，具有均匀致密的空间层次感，改善凝胶三维网络结构，同时将更多水分子截留在凝胶网络中，增强凝胶的凝胶特性。因此，碱法（pH12.0-5.5）提取制得的分离蛋白，其凝胶具有均匀致密的微观结构，增强了凝胶特性，提高了持水性能。

2.7 白鲢鱼分离蛋白的动态热图分析

为进一步研究酸/碱等电点沉淀法对白鲢鱼分离蛋白品质的影响，将其关键指标进行聚类动态热图分析。白鲢鱼肉分离蛋白的动态热图见图4。蓝色颜色越深表示其与关键指标呈负相关，而红色颜色越深表示其与关键指标呈正相关。

图4 白鲢鱼肉分离蛋白的动态热图Fig.4 Heatmap of silver carp protein isolate

由图4 可知，根据不同酸/碱等电点沉淀法制备的白鲢鱼分离蛋白品质的差异，将白鲢鱼肉分离蛋白分为三大类，分别为I 类[酸法（pH3.0-5.5 和pH4.0-5.5）提取制得的分离蛋白组]、II 类[碱法（pH11.0-5.5）提取制得的分离蛋白组]和III 类[碱法（pH12.0-5.5 和pH13.0-5.5）提取制得的分离蛋白组]。结果表明，I 类具有弱的凝胶特性、低的持水性，且必需氨基酸的含量低和非必需氨基酸的含量高等特点，II 类的特点适中，而III 类的特点恰与I 类的相反，具有强的凝胶特性、高的持水性，且必需氨基酸的含量高和非必需氨基酸的含量低等特点。综合分析，碱法（pH12.0-5.5）提取制得的分离蛋白的蛋白质含量高、氨基酸种类齐全，必需氨基酸含量高，且形成凝胶的性质强，因此碱法（pH12.0-5.5）制备的分离蛋白的品质最优，且营养特性好。

3 结论

采用酸/碱等电点沉淀法提取白鲢鱼分离蛋白的得率均超过54%，且碱法（pH12.0-5.5 和pH13.0-5.5）提取制备白鲢鱼分离蛋白的得率较高。与酸法制备的分离蛋白相比，碱法制备分离蛋白的蛋白质含量高、粗脂肪含量低、溶解性强，其中碱法制备（pH12.0-5.5）的分离蛋白的蛋白质含量最高，达81.96 g/100 g，且水分含量仅为9.76 g/100 g，制备的分离蛋白氨基酸种类齐全，必需氨基酸含量占氨基酸总量比值在42.27%以上，同时亮氨酸和赖氨酸含量高，符合FAO/WHO 的蛋白质理想模式。此外，与酸法提取相比，碱法提取制备的分离蛋白，其凝胶三维网络结构致密有序均匀，具有强的凝胶特性和高的持水性能，因此碱法（pH12.0-5.5）提取制得的分离蛋白的营养特性和功能特性最佳。