雪莲菌发酵对苹果渣膳食纤维结构和功能特性的影响

荆淳，岳田利，2*，袁亚宏，2，刘敏

（1.西北农林科技大学食品科学与工程学院，陕西 咸阳 712000；2.西北大学食品科学与工程学院，陕西 西安 710000）

膳食纤维（dietary fiber，DF）是一类在胃和小肠中不能消化但在大肠中可以部分或完全消化的物质总称，DF 根据溶解度可分为可溶性膳食纤维（soluble dietary fiber，SDF）和不溶性膳食纤维（insoluble dietary fiber，IDF）[1]。研究表明IDF 可以促进肠道蠕动增加粪便量，SDF 可以通过肠道菌群进行发酵，调节肠道内pH 值，促进有益菌的生长和繁殖，使肠道菌群保持平衡[2]。因此DF 对维持机体健康起到重要作用。

苹果是蔷薇科属植物，含有丰富的粗纤维、果糖、胶质和微量元素等物质。苹果渣是苹果制造加工过程中的副产品，含有大量的DF。但是由于传统方法制备的苹果渣DF 主要成分是IDF，通常被当做食品加工废弃物，从而造成资源浪费和环境破坏[3]。微生物发酵能降解果蔬的IDF，使大分子IDF 部分转化为小分子SDF，提高SDF 的含量，改善DF 的结构特征和生物活性[4]。雪莲菌是天然混菌发酵体系，含有乳酸菌、酵母菌和少量的醋酸菌，发酵过程中会产生纤维素酶，分解IDF[5]。利用雪莲菌发酵豆渣DF，显著地提高SDF 的含量，提高SDF 的抗氧化能力[6]，因此探究雪莲菌发酵对苹果渣DF 的基础结构、理化性质和功能特性的影响具有研究意义。

本研究以雪莲菌发酵最佳条件下制备的苹果渣DF 为研究对象，对比发酵前后的IDF 和SDF 基本结构特征、物理化学性质和体外功能活性的差异，进而探讨雪莲菌发酵对苹果渣DF 的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

“洛川”苹果、大豆油、鸡蛋：市售；耐高温α-淀粉酶（食品级，酶活力≥4 000 U/g）、淀粉糖化酶（食品级，酶活力≥100 U/mg）、中性蛋白酶（食品级，酶活力≥800 U/mg）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；雪莲菌（天然混菌发酵）：保藏于西北农林科技大学食品科学与工程学院健康食品制造与安全控制实验室。

1.2 仪器与设备

激光粒度分析仪（LS13320）：美国贝克曼库尔特公司；傅里叶变换红外光谱仪（vertex70）：德国布鲁克公司；扫描电子显微镜（Nano SEM-450）：美国FEI 公司；恒温水浴锅（DK-98-II）：天津市泰斯特仪器有限公司；电热鼓风干燥箱（WGL-230B）：中仪国科（北京）科技有限公司；紫外分光光度计（UV-2600）：日本岛津公司；立式压力蒸汽灭菌器（YXQ-LS-70A）：上海博迅实业有限公司医疗设备厂；旋转蒸馏仪（RE-52AA）：上海亚荣生化仪器厂；高速冷冻离心机（HC-3018R）：安徽中科中佳科学仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 发酵前后苹果渣膳食纤维的制备

苹果切块后与适量的蒸馏水混合放进搅拌机中打碎制作成苹果泥，121 ℃灭菌30 min，取出后过滤得到未发酵苹果渣。

雪莲菌菌粒培养于灭菌乳中，置于25 ℃条件下恒温培养，每48 h 更换一次灭菌乳，连续培养3 d，备用。将雪莲菌接种至灭菌苹果泥中，28 ℃摇床培养2 d。取出后121 ℃灭菌30 min，取出后过滤得到发酵苹果渣。将未发酵苹果渣和发酵苹果渣置于50 ℃下干燥48 h，粉碎过100 目标准筛。

DF 的制备参考Xia 等[7]的方法，稍作修改。取50 g苹果渣于烧杯中，按照1∶5（g/mL）的料液比加入250 mL蒸馏水，混匀，用磷酸盐缓冲液调pH 值至6.0，加入0.5 g 耐高温α-淀粉酶，80 ℃水浴40 min。每隔5 min 摇动烧杯，混合物冷却至室温，调节pH 值至7.5，并加入0.25 g 中性蛋白酶，40 ℃水浴60 min。混合物冷却至室温，调节pH 值至4.5，并加入0.25 g 淀粉糖化酶，60 ℃水浴30 min，水浴期间连续搅拌。混合物沸水浴5 min 灭酶活，4 800 r/min 离心10 min，70 ℃热水洗涤沉淀2 次，丙酮冲洗沉淀2 次，95%乙醇冲洗2次，蒸馏水冲洗2 次，沉淀经过冷冻干燥后为苹果渣不溶性膳食纤维（A-IDF）和发酵苹果渣不溶性膳食纤维（F-IDF）。合并上清液，旋转蒸发至原体积的1/4，再用4 倍体积95%乙醇进行醇沉过夜，离心10 min，醇沉物经过冷冻干燥后为苹果渣可溶性膳食纤维（A-SDF）和发酵苹果渣可溶性膳食纤维（F-SDF），样品置于-20 ℃的冰箱中保存备用。

1.3.2 单因素试验

F-SDF 得率为F-SDF 质量占总膳食纤维的质量的百分比。以F-SDF 得率为指标，在发酵时间48 h、接种量5%时、控制发酵温度分别为26、28、30、32、34 ℃，进行发酵温度单因素试验。在发酵时间48 h、发酵温度30 ℃时，控制接种量分别为1%、3%、5%、7%和9%，进行接种量单因素试验。在接种量5%、发酵温度30 ℃时，控制发酵时间分别为24、36、48、60、72 h，进行发酵温度单因素试验。初步确定雪莲菌发酵苹果渣DF 的工艺条件。

1.3.3 正交试验优化

在单因素试验的基础上，选择发酵温度、接种量和发酵时间的适宜范围，采用L9（34）方案进行正交试验优化，因素与水平设计见表1。

表1 正交试验因素与水平Table 1 Factors and levels of orthogonal test

1.3.4 粒径测定

采用激光粒度分析仪测定2 mg A-IDF、F-IDF、ASDF 和F-SDF 样品的粒径分布。

1.3.5 扫描电镜观察

将A-IDF、F-IDF、A-SDF 和F-SDF 冻干样品置于导电胶上，喷金，采用扫描电镜进行800 倍观察。

1.3.6 傅里叶变换红外光谱测定

将2 mg A-IDF、F-IDF、A-SDF 和F-SDF 样品与200 mg KBr 混合压片，于4 000～400 cm-1范围内对压片进行扫描，获得红外光谱图。

1.3.7 持水力（water holding capacity，WHC）的测定

分别将A-IDF、F-IDF、A-SDF 和F-SDF 样品置于离心管中，加入去离子水，搅拌均匀，3 500 r/min 离心15 min，除去上清液，并称重。持水力计算公式如下。

式中：W 为持水力，g/g；m1为样品吸附水分后的湿重，g；m0为样品吸附水分前的干重，g。

1.3.8 持油力（oil holding capacity，OHC）的测定

将A-IDF、F-IDF、A-SDF 和F-SDF 样品与大豆油混合，静置12 h，3 500 r/min 离心15 min，除去上层和管壁残留的油脂，称量吸油后样品的质量。持油力计算公式如下。

式中：O 为持油力，g/g；m2为样品吸附油脂饱和后样品的质量，g；m0为样品吸附油脂前样品的质量，g。

1.3.9 吸水溶胀力（water swell capacity，WSC）的测定

将A-IDF、F-IDF、A-SDF 和F-SDF 样品加入到去离子水中，然后静置12 h，记录样品吸附水分前后的体积变化。吸水溶胀力计算公式如下。

式中：S 为吸水溶胀力，mL/g；v1为吸水后样品的体积，mL；v0为吸水前样品的体积，mL；m0为吸水前样品的质量，g。

1.3.10 胆固醇吸附力（cholesterol adsorption capacity CAC）测定

配制1 mg/mL 胆固醇标准液，分别取0、20、40、60、80、100 μL 胆固醇标准液于试管中，加入500、480、460、440、420、400 μL 冰醋酸，混匀标号，分别取100 μL 胆固醇标准液，加50 μL 铁矾显色剂，摇匀后静置60 min，用酶标仪在560 nm 处测定吸光度，绘制胆固醇标准曲线。

将A-IDF、F-IDF、A-SDF 和F-SDF 样品与2 mL蛋黄乳液混合，以3 000 r/min 离心10 min，取100 μL上清液，加50 μL 铁矾显色剂，摇匀后静置60 min，用酶标仪在560 nm 处测定吸光度，带入胆固醇标准曲线算出上清液的胆固醇含量。磷酸缓冲液代替样品与2 mL 蛋黄乳液混合，以3 000 r/min 离心10 min，取

100 μL 上清液，加50 μL 铁矾显色剂，摇匀后静置60 min，用酶标仪在560 nm 处测定吸光度，带入胆固醇标准曲线算出总胆固醇含量。胆固醇吸附力计算公式如下。

式中：C 为胆固醇吸附力，mg/g；M1为总胆固醇含量，mg；M0为上清液的胆固醇质量，mg；m 为样品的含量，g。

1.3.11 葡萄糖吸附力（glucose adsorption capacity，GAC）测定

将2 mL A-IDF、F-IDF、A-SDF 和F-SDF 样品溶液与2 mL 葡萄糖溶液混合均匀，即最终体系中样品浓度为10 mg/mL，葡萄糖浓度为25 mmol/L。在37 ℃、180 r/min 摇匀6 h 后，3 500 r/min 离心15 min，用二硝基水杨酸法测定上清液葡萄糖含量。葡萄糖吸附力计算公式如下。

G=（C1-C0）×V0/m

式中：G 为葡萄糖吸附力，mmol/g；C1为总葡萄糖浓度，mol/L；C0为上清液葡萄糖浓度，mol/L；V0为混合液体积，mL；m 为样品质量，g。

1.4 数据处理与分析

数据均以平均值±标准差表示，采用统计学软件Minitab 18 对数据进行数据显著性分析（ANOVA），运用Origin 2022 作图软件进行作图。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 发酵温度对F-SDF 得率的影响

发酵温度对F-SDF 得率的影响如图1 所示。

图1 发酵温度对F-SDF 得率的影响Fig.1 Effect of fermentation temperature on the yield of F-SDF

由图1 可知，发酵温度26～28 ℃时，随着发酵温度的增加，F-SDF 得率呈上升趋势。在28 ℃时达到最大值（64.53%）。发酵温度超过28 ℃后，F-SDF 得率随着发酵温度的增加呈下降趋势，这是因为雪莲菌有最适的生长温度，在过低或过高的温度环境下，生长代谢速度会受到抑制，故选择26、28、30 ℃进行正交优化试验。

2.1.2 接种量对F-SDF 得率的影响

接种量对F-SDF 得率的影响如图2 所示。

图2 接种量对F-SDF 得率的影响Fig.2 Effect of inoculum volume on the yield of F-SDF

由图2 可知，接种量在1%～5%时，随着接种量的增加，F-SDF 得率不断增加。在接种量5%时达到最大值（65.39%），但当接种量在5%～9%时，F-SDF 得率随着接种量的增加而下降，这是因为接种量过高，底物营养物质不足以供给菌体生长，影响雪莲菌的发酵能力，导致F-SDF 得率下降。故选择3%、5%、7%进行正交优化试验。

2.1.3 发酵时间对F-SDF 的得率的影响

发酵时间对F-SDF 的得率的影响如图3 所示。

图3 发酵时间对F-SDF 的得率的影响Fig.3 Effect of fermentationtime on the yield of F-SDF

由图3 可知，随着发酵时间的延长，F-SDF 的得率呈现上升的趋势，但48 h 后，随着发酵时间继续延长，F-SDF 得率的增幅变缓，这是因为较短发酵时间的菌种处于生长期，菌种数量少活性低，随着发酵时间的延长，菌种生长进入稳定期，持续发酵后，发酵产生的次生代谢产物会利用SDF，同时底物的不断消耗和产物的大量生成会抑制菌种的活性，造成F-SDF 得率增长缓慢，故选择36、48、60 h 进行正交优化试验。

2.2 正交试验结果与分析

发酵苹果渣DF 正交水平试验结果见表2。

表2 发酵苹果渣DF 正交试验结果Table 2 Results of orthogonal experiments on the preparation of DF from apple pomace by fermentated

由表2 和表3 可知，3 次正交验证试验结果的FSDF 得率平均值为68.28%，高于正交9 组试验中最优结果，证明正交试验具有合理性，所以正交试验最优发酵条件组合为A2B3C3，即发酵温度28 ℃、接种量7%、发酵时间60 h。

表3 发酵苹果渣DF 正交试验验证结果Table 3 Results of orthogonal tests for preparation of DF from apple pomace by fermentated

发酵苹果渣DF 正交试验结果方差分析见表4。

表4 发酵苹果渣DF 正交试验结果方差分析Table 4 ANOVA for results of orthogonal tests on the preparation of DF from apple pomace by fermentated

由表4 可知，3 个因素对F-SDF 得率的影响顺序是B＞A＞C，即接种量＞发酵温度＞发酵时间。其中接种量对F-SDF 得率的影响显著，发酵温度和发酵时间对F-SDF 得率的影响不显著。

2.3 发酵对苹果渣膳食纤维粒径的影响

A-IDF、F-IDF、A-SDF 和F-SDF 的粒径分布如图4 所示。

图4 雪莲菌发酵前后苹果渣IDF 和SDF 的粒径分布Fig.4 Particle size distribution of apple pomace IDF and SDF before and after Tibetan kefir grain fermentation

由图4 可知，A-SDF 的粒径明显小于A-IDF，经过发酵处理F-IDF 和F-SDF 的粒径差距不明显，AIDF 和A-SDF 由双峰粒径分布变成单峰粒径分布且分布曲线开度明显收窄，峰值明显提高，尤其是A-IDF经过发酵后，粒径的峰值明显向前移动，这说明经过发酵后IDF 和SDF 的粒径尺寸分布均匀，A-IDF 的粒径尺寸明显减小，这与秦续缘等[8]研究结果相似，发酵后的黑果腺肋花楸不溶性膳食纤维粒径明显减小。

2.4 扫描电镜观察

图5 为A-IDF、F-IDF、A-SDF 和F-SDF 的扫描电镜图像（800 倍）。

图5 雪莲菌发酵前后苹果渣IDF 和SDF 的扫描电镜图Fig.5 SEM images of IDF and SDF of apple pomace before and after Tibetan kefir grain fermentation

由图5 可知，与A-SDF 和F-SDF 相比，A-IDF 和F-IDF 块状物的体积更大，表面更加的粗糙。A-IDF 的颗粒形态完整，结构清晰呈块状。与A-IDF 相比，F-IDF更加疏松，出现许多裂缝，呈现出海绵状的结构，还有许多的不规则孔隙，这是由于发酵过程中IDF 利用发酵所产生的纤维素酶和代谢产物使其表面的蛋白质分子和淀粉被去除，从而导致内部开口结构的露出[9]。A-SDF 的块状物质数量明显少于A-IDF，但是A-SDF的颗粒分布不均匀，经过发酵后F-SDF 的块状物质明显减少，同时颗粒分布的更加均匀。Kumari 等[10]研究表明DF 的结构越疏松、孔隙越多和颗粒分布越均匀，其功能特性越强。因此，雪莲菌发酵提高DF 的功能特性。

2.5 发酵对苹果渣膳食纤维官能团的影响

雪莲菌发酵前后苹果渣IDF 和SDF 的红外光谱图见图6。

图6 雪莲菌发酵前后苹果渣IDF 和SDF 的红外光谱图Fig.6 FT-IR spectra of apple pomace IDF and SDF before and after Tibetan kefir grain fermentation

由图6 可知，A-IDF、F-IDF、A-SDF 和F-SDF 的总体光谱特征相似，但是在波数上某些特征谱带发生微弱偏移。3 400 cm-1附近出现O—H 伸缩振动带，这是典型的半纤维中糖醛酸O—H 的伸缩振动峰；2 930～2 920 cm-1处是典型的纤维素结构，产生振动的原因与亚甲基上和甲基C—H 的伸展有关；1 750～1 740 cm-1与1 635～1 610 cm-1处是糖醛酸特有的C=O 键或乙酰基；1 433 cm-1处是由于木质素的存在，芳香族或脂肪族C—H 振动的结果；1 375.6 cm-1和1 323.5 cm-1处是纤维素结构的O—H 基团造成的振动；1 244.3 cm-1处是半纤维素C—O 基团的特征峰；1 150～1 050 cm-1处的吸收峰则由于木质素或半纤维素的C—O—O 伸缩振动；600～500 cm-1处是β-糖苷键的吸收峰[11-13]。结果表明：A-IDF、F-IDF、A-SDF 和F-SDF 具有典型的DF结构，都含有纤维素、半纤维素、木质素和果胶，这说明经过发酵处理的F-IDF 和F-SDF 重要官能团没有被破坏，重要亲水基团和活性基团与发酵前类似，Ma 等[14]研究表明复合酶发酵土豆渣DF 未改变其基本结构，重要官能团在DF 发挥功能活性上起着重要作用。

2.6 持水力、持油力和吸水溶胀力的结果分析

雪莲菌发酵前后苹果渣膳食纤维的持水力、持油力和吸水膨胀力见表5。

表5 雪莲菌发酵前后苹果渣膳食纤维的持水力、持油力和吸水膨胀力Table 5 WHC，OHC and WSC of dietary fiber from apple pomace before and after Tibetan kefir grain fermentation

持水力是DF 水合能力的一个重要的评价指标，因为较高的持水力可以增加粪便的体积，加快肠道蠕动的速度，同时提高DF 感官评分[15]。由表5 可知，IDF持水力显著高于SDF（p＜0.05），F-IDF 的持水力显著高于A-IDF（p＜0.05），F-SDF 的持水力显著高于A-SDF（p＜0.05）。这是因为发酵产生的酶作用于DF，使DF 的结构变得更加疏松，粒径变小，而粒径越小，结构越疏松，DF 与水接触机率就越高[16]，因此雪莲菌发酵可以增加DF 与水分接触的面积从而显著增加持水力。

持油力反映DF 能够吸附油脂的多少，DF 的持油力越高，吸附胆酸盐的能力就越强，持油力与DF 的结构和粒径大小有关[17]。由表5 可知，SDF 持油力显著高于IDF（p＜0.05），这是由于SDF 和IDF 的结构存在明显的差异，与IDF 相比，SDF 更加疏松多孔、粉质细腻、比表面积大，与油脂的接触面积就更大[18]，因此SDF 持油力远远高于IDF。F-IDF 的持油力显著高于A-IDF（p＜0.05），F-SDF 的持油力显著高于A-SDF（p＜0.05），这与Sun 等[19]研究结果相似，IDF 的粒径越小，持油力越高。

吸水溶胀力是衡量DF 功能特性的重要指标，与DF 的无定型结构和表面亲水基团有关[20]。由表5 可知，IDF 溶胀力显著高于SDF（p＜0.05），F-IDF 的吸水溶胀力显著高于A-IDF（p＜0.05），F-SDF 的吸水溶胀力显著高于A-SDF（p＜0.05）。研究发现发酵DF 更加疏松多孔，无定型结构和亲水基团暴露出来[21]，这说明雪莲菌发酵改变IDF 和SDF 的结构，使其内部基团暴露，提高苹果渣DF 的功能特性。

2.7 胆固醇吸附力结果分析

雪莲菌发酵前后苹果IDF 和SDF 的胆固醇吸附力见图7。

图7 雪莲菌发酵前后苹果渣IDF 和SDF 的胆固醇吸附力Fig.7 Cholesterol adsorption of IDF and SDF of apple pomace before and after Tibetan kefir grain fermentation

由图7 可知，在pH 值相同的条件下，SDF 的胆固醇吸附力显著高于IDF（p＜0.05），F-IDF 的胆固醇吸附力显著高于A-IDF（p＜0.05），F-SDF 的胆固醇吸附力显著高于A-SDF（p＜0.05），A-IDF 发酵后胆固醇吸附力显著提高21.94%（p＜0.05），A-SDF 发酵后胆固醇吸附力显著提高15.46%（p＜0.05）。这是由于发酵改变IDF 和SDF 的基础结构，与A-IDF 和A-SDF 相比，FIDF 和F-SDF 的平均粒径减小，粒径分布更加均匀，这会增加DF 吸附胆固醇的面积[22]，此外，不同pH 值会影响IDF 和SDF 胆固醇吸附力，pH7.0 条件下IDF 和SDF 胆固醇吸附力显著高于pH2.0 条件下的相应指标（p＜0.05）。这一结果与朱妞[23]绿色发酵制备苹果渣DF 发现类似，DF 在模拟肠道环境（pH7.0）下的胆固醇吸附力显著高于在模拟胃环境（pH2.0）下的胆固醇吸附力。

2.8 葡萄糖吸附力

雪莲菌发酵前后苹果渣IDF 和SDF 的葡萄糖吸附力见图8。

图8 雪莲菌发酵前后苹果渣IDF 和SDF 的葡萄糖吸附力Fig.8 The glucose adsorption of IDF and SDF of apple pomace before and after Tibetan kefir grain fermentation

由图8 可知，SDF 的葡萄糖吸附力显著高于IDF（p＜0.05），F-IDF 的葡萄糖吸附力显著高于A-IDF（p＜0.05），F-SDF 的葡萄糖吸附力显著高于A-SDF（p＜0.05），A-IDF 发酵后葡萄糖吸附力显著提高34.50%（p＜0.05），A-SDF 发酵后葡萄糖吸附力显著提高23.27%（p＜0.05）。与F-SDF 相比，F-IDF 的葡萄糖吸附力提高效果更显著，但F-SDF 的葡萄糖吸附能力更强。研究发现DF 葡萄糖吸附能力与SDF 含量和DF 结构有关，DF 中SDF 的含量越高，DF 的结构越疏松，吸附葡萄糖的能力越强[24]。因此雪莲菌发酵提高DF 的葡萄糖吸附力与SDF 的提取率增加和DF 的粒径尺寸减少有较大关系。

3 结论

雪莲菌发酵制备苹果渣DF 最佳工艺参数为发酵温度28 ℃、接种量7%、发酵时间60 h，该条件下苹果渣SDF 得率为68.28%。发酵后苹果渣SDF 含量显著提高，发酵不仅影响苹果渣DF 的基础结构，还影响功能特性。发酵后的DF 结构特征更加膨松多孔，持水力、持油力、溶胀力、胆固醇吸附力和葡萄糖吸附力均显著提高。雪莲菌发酵可以改善DF 的结构，提高DF 的功能特性，是一种具有潜力的微生物改性方法，但对于雪莲菌发酵后苹果渣DF 的物质组成有待进一步研究。