组氨酸磷酸酶在某些疾病发病中作用的研究进展

国 鸽，刘春蕾

中国人民解放军总医院 医学创新研究部 转化医学研究中心，北京 100853

蛋白质磷酸化的发现至今已有百年历史,这种蛋白质的修饰形式能够关键性的调节蛋白质的多种功能,例如控制细胞的增殖、分化及对外界刺激的反应。组氨酸的磷酸化由组氨酸激酶(histidine kinase)催化完成,其去磷酸化的过程由组氨酸磷酸酶(histidine phosphatase)介导。1962年首次在牛线粒体中发现组氨酸磷酸酶,但直到2000年左右研究人员才重新重视起磷酸组氨酸的生物学功能。对磷酸组氨酸的文献研究也逐渐从原核生物、真菌和植物过渡到哺乳动物的信号传导过程。组氨酸磷酸酶参与调控多种生物学过程,其水平异常也会导致许多临床疾病的发生。本文将分别从组氨酸磷酸酶的组成、组氨酸磷酸酶与临床疾病的联系,以及新建立的组氨酸磷酸酶活性检测技术作一简要综述。

1 组氨酸磷酸酶

组氨酸磷酸酶共有3种, 分别是磷酸化磷酸组氨酸无机焦磷酸磷酸酶(phospholysine phosphohistid-ine inorganic pyrophosphate phosphatase, LHPP)、14 ku磷酸组氨酸磷酸酶(phosphohistidine phosphatase 1,PHPT1)和磷酸甘油酸变位酶家族5(phosphoglyce-rate mutase family 5, PGAM5)。LHPP主要在大脑、肾脏和肝脏中表达,其特异性底物尚未确定[1];PHPT1是一种胞质蛋白,主要在心脏和骨骼肌中的表达量高,其磷酸酶底物包括四聚体钙激活钾通道(Ca2+-activated K channels, KCa3.1)、新型Ca通道(transient receptor potential vanilloid 5,TRPV5)、ATP-柠檬酸裂解酶(ATPcitrate lyase, ACL)、鸟嘌呤核苷酸的调节蛋白β-亚单位(β-subunit of heterotrimeric G protein, Gβ);PGAM5是一种线粒体膜蛋白磷酸酶,定位于线粒体的内膜、外膜和细胞质中,其唯一底物是核苷二磷酸激酶B (nucleoside diphosphate kinase B,NDPK-B)。

2 组氨酸磷酸酶与疾病

组氨酸的磷酸化改变参与多种生物学过程调控。组氨酸磷酸酶的表达或活性异常会引发生物功能紊乱,进而引起相关的疾病。

2.1 组氨酸磷酸酶与肿瘤

LHPP是一种肿瘤抑制因子,其表达异常与肿瘤的发生发展密切相关。宫颈癌是常见的直接影响女性健康的恶性肿瘤[2],与相邻正常组织相比,人宫颈癌肿瘤组织中LHPP表达显著降低。LHPP高表达有助于降低宫颈癌细胞的增殖、迁移和侵袭[3]。不仅是宫颈癌,在多种肿瘤疾病中,LHPP均可减缓癌细胞的转移和侵袭。胰腺癌是最常见的胰腺肿瘤,恶性程度极高。在胰腺癌中,LHPP能够抑制肿瘤的增殖、迁移和侵袭并增加细胞凋亡,LHPP表达下调具有致癌作用[4]。肝癌的发病率和病死率都很高。在肝癌中,LHPP高表达降低了肿瘤负荷,并同时降低肝脏损伤相关的血清学指标丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase,ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase,AST)、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)的表达。LHPP在肿瘤中的保护作用机制,主要涉及Akt, TGF-β等相关信号通路。LHPP通过抑制TGF-β/smad信号通路抑制肝内胆管癌的发生[5]。在胶质母细胞瘤中,LHPP通过下调Akt和Wnt/β-catenin信号通路发挥肿瘤抑制作用[6],并且LHPP的表达量与患者的中位生存期相关,LHPP高表达有助于改善胶质母细胞瘤患者的预后。在膀胱癌中,LHPP通过灭活的AKT/p65信号通路抑制膀胱癌细胞增殖[7]。

PHPT1对维持正常细胞稳态起重要作用,它的表达失调与疾病的发生密切相关。PHPT1在肝癌细胞中表达量升高,利用特异性小干扰RNA抑制PHPT1后,部分抑制细胞的增殖。PHPT1对HepG2和SMMC7721细胞的刺激作用表明PHPT1基因可能是直接或间接控制细胞增殖的生长启动子基因,这些基因的产物调控细胞的增殖和分化,从而促进肿瘤的发展,说明PHPT1在肝细胞癌中可能起到肿瘤启动子的作用。PHPT1异常表达参与肿瘤细胞的运动和肿瘤的转移。在肺癌细胞中,干扰PHPT1后抑制肿瘤的迁移和侵袭。PHPT1对肿瘤细胞运动的影响与细胞运动的一种重要结构细胞层状伪足形成密切相关,通过调节肌动蛋白介导细胞骨架重排,从而影响肺癌细胞的迁移和侵袭[8]。另外,在肾透明细胞癌患者中,PHPT1高表达与肿瘤大小的增加及患者的预后不良相关[9]。

PGAM5是线粒体自由基线粒体降解的调节因子[10]。结直肠癌患者的PGAM5表达水平显著降低[11],而活化PGAM5则可抑制结直肠癌细胞凋亡,进而抑制结直肠癌[12]。在前列腺癌患者中,PGAM5以复合物Bax-PGAM5-LDrp1的形式存在,通过增加癌细胞凋亡,抑制肿瘤的发生发展。PGAM5诱导细胞抑癌因子Bax激活和Drp1去磷酸化,若将PGAM5敲除后抑制Bax向线粒体的易位和降解,进而抑制前列腺癌细胞的凋亡。

2.2 组氨酸磷酸酶与代谢疾病

棕色脂肪细胞因含有大量线粒体,以产热的形式消耗能量[13],是预防和治疗肥胖症的重要靶标,PHPT1参与调控棕色脂肪细胞的分化过程。在棕色细胞分化的早期PHPT1迅速降低并在后期恢复,PHPT1降低促进棕色脂肪细胞的分化,PHPT1增加抑制棕色脂肪细胞的分化。这一作用使其有望成为治疗肥胖等相关代谢病的治疗靶点[14]。另外,PGAM5可通过抑制解偶联蛋白1的表达抑制棕色脂肪细胞的能量消耗[15]。PGAM5敲除会刺激脂质消耗,抑制棕色脂肪细胞中脂质积累。

组氨酸磷酸酶可促进脂肪细胞葡萄糖氧化,适当水平的组氨酸磷酸酶可维持血糖稳定。胰岛素是人体内唯一能降低血糖的激素,由胰岛β细胞分泌。胰岛β细胞的生物学调控在葡萄糖稳态中起着关键作用。PHPT1 在正常胰岛β细胞中有调节血糖的作用,胰岛β细胞中PHPT1表达水平改变与血糖异常有关,Phpt1敲除小鼠表现出新生儿高胰岛素血症性低血糖。Phpt1敲除小鼠中,其激活瞬时受体电位通道受损,Ca2+内流减少,AMPK下游激活受损,使KATP通道到质膜的转移受损,胰岛β细胞中KATP通道缺陷诱导小鼠新生儿低血糖。与PHPT1作用不同,Pgam5敲除小鼠对严重的代谢性疾病具有抵抗性,抑制PGAM5能够改善糖尿病损伤[16]。

2.3 组氨酸磷酸酶与心脏疾病

组氨酸激酶NDPK-B与组氨酸磷酸酶PHPT1共同调节组蛋白磷酸化,是一种类似跷跷板的动态过程,与调节心肌收缩力相关。NDPK-B /PHPT1能够调节底物KCa3.1、TRPV5、Gβ相关组氨酸残基(His)的磷酸化和去磷酸化,磷酸化组氨酸通过影响心肌细胞中cAMP的形成,参与心脏收缩力的调节。在新生大鼠心肌细胞中稳定过表达NDPK-B可以使Gαs-腺苷酰环化酶(adenylate cyclase,AC)依赖性激活增强,进而增加心肌细胞的收缩力。另外,NDPK-B/Gβγ复合物通过His266处G蛋白亚基磷酸化,使G蛋白受体非依赖性激活,对胚胎早期心脏收缩力的形成至关重要。心力衰竭时心肌细胞中发生复杂的重塑过程,G蛋白信号传导的变化是这种重塑过程的标志。心力衰竭中NDPK-B /PHPT1调节异常,使Gα介导的AC活化降低,cAMP信号传导的改变导致关键心脏Ca2+处理蛋白的磷酸化减少,是心衰疾病中心室收缩性降低的重要原因。另外,PHPT1能够将KCa3.1通道中His358位点去磷酸化[17]。KCa3.1通道中His358的磷酸化对血管平滑肌细胞增殖至关重要。血管平滑肌细胞增殖是动脉粥样硬化和血管再生的重要标志。因此,通过激活PHPT1抑制KCa3.1,可能在血管增生性疾病中提供有意义的临床效果[18]。此外,PHPT1还与调节心律失常相关,在心律失常性右心室心肌病患者中发现NDPK-B和KCa3.1通道表达上调,细胞自律性增加,心律失常发生率增加。重组NDPK-B心肌干细胞可增强 KCa3.1通道电流、细胞自律性和心律失常的发生,PHPT1阻止了NDPK-B的效应,单独使用PHPT1能够减少心律失常疾病的发生[19]。

此外,LHPP与严重抑郁障碍、酒精依赖和危险行为有关[20]。PGAM5是实验性肺纤维化中线粒体功能障碍的关键驱动因素,在肺纤维化形成过程中起重要作用[21]。在神经退行性疾病帕金森病模型中,STAT5-PGAM5-Drp1信号传导破坏,导致线粒体受损、ATP 产生不足和过度氧化应激积聚。STAT5- PGAM5- LDrp1复合物激活神经元中的线粒体裂变以稳定线粒体平台,是构成神经保护的重要机制[22]。PGAM5还可通过调节线粒体动力学来调节细胞衰老[23]。

3 组氨酸磷酸酶活性相关的检测新技术

磷酸化组氨酸在相对温和条件下不稳定性,而且缺乏特异性抗体和保存、检测方法导致对组氨酸磷酸化酶的研究严重滞后。近年来,随着相应的检测技术逐渐增多,对组氨酸磷酸酶研究的越来越多。目前新建立的检测磷酸酶活性的技术主要包括:1)利用小分子底物来监测体外磷酸酶的活性。小分子底物常被用来监测体外磷酸酶的活性。虽然不能像磷酸化组氨酸的蛋白质或者多肽那样代表组氨酸磷酸酶的生物底物,但它们能够提供更简便和灵敏的方法。6,8-二氟-4-甲基伞形基磷酸酯(6,8-Difluoro-4-methylumbelliferyl phosphate,DiFMUP)是一种磷酸酪氨酸模拟分子,其荧光在磷酸化后会淬灭。去磷酸化后,DiFMUP变为强荧光。因此,DiFMUP可作为监测组氨酸磷酸酶活性的底物,用于测定组氨酸磷酸酶的活性。2)设计荧光探针用于检测组氨酸磷酸酶。最新发现设计合成荧光探针可用于检测组氨酸磷酸酶的活性。Sox-H4P探针的合成方法为Sox修饰后获得Sox-H4修饰肽,将Sox-H4与合成氨基磷酸钾在pH8的磷酸缓冲液中共孵育获得Sox-H4P。随后通过HPLC纯化,LCox-MS/MS分析验证Sox和磷酸化组氨酸的有效性。利用这个探针,可连续测量细胞裂解物中组氨酸磷酸酶活性,探针对PHPT1表现出极好的敏感性和特异性。此方法较过去更灵敏,可以更方便的获得组氨酸磷酸酶朝向磷酸化组氨酸底物的动力学参数[24]。另外,正在开发新的方法用来探测组氨酸磷酸化蛋白质组并确定其功能结果,包括负离子模式质谱分析和非天然氨基酸掺入等。这些新的工具和策略有可能克服细胞生物学中对磷酸化组氨酸理解的阻碍。

4 问题与展望

组氨酸磷酸化在疾病中的作用已逐渐得到重视。组氨酸磷酸酶的异常表达在肿瘤、代谢性疾病中发挥了重要的调节作用。一方面,可作为疾病诊断的指标,对临床疾病的预防和诊断起到提示作用。另一方面,可为相关疾病干预提供新思路。由于影响疾病发生发展的因素众多,未来研究还需要聚焦组氨酸磷酸化与临床疾病的关联,特别是明确其中关键的通路和靶点,以利于更好的靶点治疗,开发相关酶与蛋白的抑制剂或激动剂以更好的为临床转化服务。同时,还要积极研究未知的组氨酸磷酸酶、创新相关检测技术,开发更为快捷的磷酸酶活性检测技术。相信随着对组氨酸磷酸酶开展研究的增加,对组氨酸磷酸酶作用机制的进一步探索,对组氨酸磷酸酶检测技术的更新,组氨酸磷酸酶在将来的一系列医学未知领域中将会有新的应用前景。