丹参酚酸B对Hela细胞增殖、迁移及凋亡的研究

2023-08-11王文瑾张晓雨刘保安

黑龙江科学 2023年12期

王文瑾,张晓雨,刘保安,李振

(临沂大学医学院,山东临沂 276000)

宫颈癌是全球危害女性健康的第二大癌症,我国每年约有100 000新发病例[1]。目前,临床上治疗宫颈癌的主要方法有手术、放疗、化疗、免疫及靶向治疗等。但传统的化疗药物不良反应较多,肿瘤细胞会不同程度地产生耐药性,严重影响其临床应用及疗效,故而从天然产物中寻求不良反应少、毒性较低的防治药物已成为研究热点。

丹参酚酸B(Salvianolic acid B,SalB)是从丹参植物根茎中提取的缩酚酸类多羟基化合物,具有抗菌、抗炎、抗氧化,改善肾功能,促进纤维蛋白溶解,抗凝血、抗血栓及抗缺血损伤,防治心血管系统疾病,保护肝脏损伤,防治神经毒性等功能。近几年,药理学研究发现,丹参酚酸B对大肠癌细胞[2-3]、肝癌细胞[4]等具有较好的抑制效果,可有效逆转大肠癌多药耐药,发挥减毒增效作用[5-6]。目前,关于SalB对宫颈癌Hela细胞抑制作用的研究未见报道。本研究探讨了丹参酚酸B对Hela细胞增殖、迁移及凋亡的影响,为其进一步开发利用提供了科学理论依据。

1 材料与仪器

1.1 实验材料

丹参酚酸B(成都仪捷睿生物科技有限公司生产)、人宫颈癌Hela细胞株(临沂大学药理学实验室生产)、DMEM高糖(含丙酮酸钠)(北京百奥莱博科技有限公司生产)、胎牛血清(Ausbian公司生产)、PBS缓冲液(Merck公司生产)、青霉素-链霉素溶液(Merck公司生产)、胰酶消化液(杭州浦泰生物科技有限公司生产)、噻唑蓝(MTT)(Merck公司生产)、RPMI1640培养基(杭州铭特生物科技有限公司生产)、二甲基亚砜(细胞培养级)(新睿生物科技有限公司生产)、细胞培养板(北京索莱宝科技有限公司生产)、细胞培养瓶(北京索莱宝科技有限公司生产)。

1.2 仪器与设备

CO2培养箱(莱特科学仪器有限公司生产)、SW-CJ-2FD双人单面超净工作台(苏州净化生产设备有限公司生产)、离心机(湖南恒诺仪器设备有限公司生产)、倒置显微镜(奥林巴斯株式会社生产)、超低温冰箱(济南好来宝医疗器材有限公司生产)、电子天平(梅特勒托利公司生产)、DHG-9035A型电热恒温鼓风干燥箱(上海—恒科技有限公司生产)、流式细胞仪(美国BD Biosciences公司生产)、凋亡检测试剂盒(美国BD Biosciences公司生产)、全波长酶标仪(北京普天新桥技术有限公司生产)、LDZX-75KBS型立式压力蒸汽灭菌器(上海申安医疗器械厂生产)。

2 实验方法

2.1 Hela细胞的复苏和培养

取冻存的宫颈癌Hela细胞株,用常规方法复苏后,将Hela细胞培养在DMEM完全培养基(含90%DMEM培养基、10%胎牛血清及1%青霉素-链霉素)中,于37 ℃、5%CO2细胞培养箱中培养3～4 d,细胞生长到对数期,采用胰蛋白酶消化液(0.25%)处理,制成Hela细胞悬液。

2.2 SalB对Hela细胞增殖的影响

采用MTT法,测定Hela细胞增殖情况。将对数期Hela细胞(2×104/mL)按100 μL/孔接种到细胞培养板中,置于37 ℃、5%CO2培养箱中,培养24 h,分别加入SalB,使其浓度分别为0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.15、0.20 mg/mL,每组设置5个重复,并保留空白对照组,培养Hela细胞72 h后,加入20 μL浓度为5g/L的MTT溶液,继续培养Hela细胞4 h,弃去上清液,以每孔150 μL加入DMSO溶液,摇床振荡10 min,用全波长酶标仪测定Hela细胞培养液在490 nm波长处的吸光度值(A)[7]。计算Hela细胞增殖抑制率,Hela细胞增殖抑制率(%)=[(A空白对照组-A实验组)/A空白对照组]×100%。

2.3 SalB对Hela细胞迁移抑制率的影响

取对数生长期Hela细胞,接种于细胞培养板,培养24 h,贴壁,细胞生长至100%,每孔用灭菌枪头做3条平行划痕,PBS清洗3遍,除去划下的悬浮Hela细胞,用倒置显微镜对划痕拍照,以含2%胎牛血清培养基配制不同浓度(0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.15、0.20 mg/mL)SalB,培养细胞24 h,对划痕进行拍照,采用Image J软件,计算细胞培养板各组划痕面积S,并计算Hela细胞迁移抑制率[8]。Hela细胞迁移抑制率(%)=[1-(S0h-S24h)/S0h]×100%。

2.4 SalB对Hela细胞凋亡率的影响

取对数生长期Hela细胞,接种于细胞培养板,过夜培养,贴壁。分别加入0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.15、0.20 mg/mL SalB作用48 h,收集Hela细胞。采用凋亡试剂盒进行染色,以流式细胞仪检测各组细胞凋亡率[9]。

3 实验结果

3.1 MTT法检测SalB对Hela细胞增殖的影响

MTT法检测SalB对Hela细胞增殖的影响,实验结果见表1。当SalB浓度为0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.15、0.20 mg/mL时,对Hela细胞增殖均具有抑制作用,细胞增殖抑制率分别为56.56%、66.84%、70.98%、75.90%、83.40%、91.31%、95.70%,且随SalB浓度的增加,细胞增殖抑制率不断升高。

表1 SalB对Hela细胞增殖的影响

3.2 SalB对Hela细胞迁移抑制率的影响

划痕实验测定SalB对Hela细胞迁移抑制率的影响,实验结果如表2所示。结果表明,分别用0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.15、0.20 mg/mLSalB处理Hela细胞24 h后,SalB对Hela细胞迁移的抑制率分别为51.20%、67.00%、73.00%、79.10%、89.50%、96.10%、98.70%,0.15 mg/mL的SalB处理Hela细胞,能明显抑制细胞的迁移能力。但当SalB浓度增加到0.15 mg/mL后,SalB对Hela细胞迁移抑制作用增加不明显。

表2 SalB对Hela细胞迁移抑制率的影响

3.3 SalB对Hela细胞凋亡率的影响

采用流式细胞仪检测Hela细胞凋亡率,实验结果见表3。分别用0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.15、0.20 mg/mL SalB作用Hela细胞48 h后,细胞凋亡率分别为1.06%、3.79%、9.64%、14.47%、23.23%、30.18%、37.25%、41.32%。说明SalB可促进Hela细胞的凋亡,且随着SalB浓度的增加而不断增强。

表3 SalB对Hela细胞凋亡率的影响

4 讨论

丹参是常用的传统中药,含有二萜醌类、酚酸类及其他类化合物,具有祛瘀止痛、活血通经、清心除烦等作用。研究发现,丹参酮ⅡA可抑制肿瘤细胞生长、侵袭、迁移、诱导凋亡及分化[10]。王冬[11]等采用细胞体外培养方法,取0～8.0 μg/mL浓度的丹参酮ⅡA作用Hela细胞72 h,可明显抑制并诱导宫颈癌细胞凋亡。沈隽[12]等报道,丹参酮ⅡA能加快HeLa细胞凋亡,用药48h后,可使Bcl-2基因mRNA的表达水平明显降低,CX43表达上调,SKP2表达减少[13]。

丹参素是丹参的主要有效成分。唐艳[14]等报道,丹参素浓度在20～100 μg/mL时,能抑制Hela细胞增殖,降低Hela细胞迁移能力。汤中杰[2]等在前期体、内外研究中发现,丹参酚酸B具有明确的抗癌作用。这与本研究结果一致。在一定浓度范围内,丹参酚酸B量效相关性抑制大肠癌LOVO细胞生长,浓度依赖性抑制LOVO细胞SOX2OT表达,抑制LOVO细胞侵袭转移[2]。郭飘婷[15]等研究发现,SalB能促进大肠癌HCT-116细胞内ROS水平,阻滞细胞周期于G0/G1期,进而量效相关性抑制细胞增殖并促进细胞凋亡。丹参酚酸B可作为自噬诱导剂,通过PI3K/Akt通路抑制,抗结直肠癌细胞[16],使肝癌SMMC7721和HepG2细胞的AT1R表达下调,VEGF的分泌减少,以旁分泌的形式作用于血管内皮细胞,从而影响肿瘤血管的生成[17]。Yang[18]等报道,丹参酚酸B对口腔鳞状癌细胞生长抑制作用机制可能与肿瘤血管的生成过程中某些关键调控基因的表达减少有关。但关于SalB抑制宫颈癌Hela细胞的作用机制未见报道,有待进一步研究。